WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||

Рис. 9. Электрофоретический анализ взаимодействия SsoIF2, его димеров и субъединиц с MjaL1мРНК-49 в присутствии ГТФ (в 3%-ном агарозном геле в неденатурирующих условиях).

Третий домен -субъединицы обозначен как D3. Двадцатикратный избыток субъединицы отмечен звездочкой.

Справа схематично показано направление движения РНК-белковых комплексов к катоду (-) или аноду (+).

Из полученных данных можно сделать несколько заключений. Во-первых, субъединица, а именно ее подвижные первый и второй домены, вносят вклад в ассоциацию SsoIF2 с мРНК, которую, главным образом промотирует -субъединица.

Во-вторых, несмотря на то, что изолированная -субъединица не обладает выраженными мРНК-связывающими свойствами, не исключено, что -субъединица непосредственно контактирует с мРНК в составе фактора. Согласно литературным данным первый домен -субъединицы обладает общими РНК-связывающими свойствами [Yatime et al., 2004]. В-третьих, наличие -субъединицы дает возможность SsoIF2 в присутствии в окружающей среде ГТФ связывать мРНК. Это наводит на мысль, что в клетке, где концентрация ГТФ на порядок превышает концентрацию ГДФ, должен существовать механизм, позволяющий второму фактору инициации трансляции взаимодействовать с мРНК. По-видимому, субъединица занимает далеко не последнее место в реализации такого механизма.

4. Получение и кристаллизация тройственного комплекса MetтРНКf•SsoIF2D3•GDPNP Параллельно с кристаллизацией и исследованиями структуры -субъединицы и гетеротримерного фактора нами в течение четырех лет велась работа по получению и кристаллизации тройственного комплекса Met-тРНКi•SsoIF2•ГТФ. Для получения тройственного комплекса, в первую очередь, необходимо было наладить выделение биологически активных инициаторных тРНК в препаративных количествах.

Получение биологически активных инициаторных тРНК Согласно опубликованным биохимическим данным архейный фактор инициации трансляции 2, практически, с одинаковым сродством взаимодействует как с архейной инициаторной Met-тРНКi, так и с бактериальной Met-тРНКf. [Yatime et al., 2004; 2006]. Поэтому для кристаллизации решено было получить обе РНК:

архейную тРНКi S. solfataricus и бактериальную тРНКf E. coli. Эта работа проводилась совместно с Н.В. Зелинской и Е.А. Шепелем. Для суперпродукции бактериальной тРНКf достаточно было встроить в вектор геномный фрагмент, содержащий ген предшественника тРНК, ограниченный собственными природными промотором и терминатором. В результате процессинга в клетках образуется зрелая тРНКf с уникальными 5'- и 3'-концами и необходимыми модификациями. Сложнее обстоит дело с продукцией в клетках E. coli чужеродной тРНК, т.к. природный промотор транскриптона архейной тРНКi не может использоваться РНКполимеразой E. coli. В таких ситуациях прибегают к методу получения синтетического гена тРНК [Meinnel et al., 1988]. В вектор встраивается кассета, содержащая синтетический липопротеиновый промотор lpp, ген зрелой инициаторной тРНК S. solfataricus и терминатор rrnC оперона E. coli.

Суперпродукцию обеих инициаторных тРНК проводили в специальном штамме E.

coli – MRE600, не содержащим РНКазы I. Уровень синтеза рекомбинантных инициаторных тРНК оценивали по степени их аминоацилирования меченым метионином, для чего использовали препараты суммарной тРНК из штаммовсуперпродуцентов. Получение препаратов суммарной тРНК проводили по классической методике Zubay (1962) с небольшими изменениями.

Аминоацилирование метионином проводили с помощью каталитического домена метионил-тРНК-синтетазы E. coli, выделенного из клеток штамма-суперпродуцента E. coli BL21(DE3)/pET28(+)-MetRS5476His [Alexander and Schimmel, 1999]. Из рисунка 10 видно, что в штаммах-суперпродуцентах для тРНКi S. solfataricus и тРНКf E. coli содержание инициаторной тРНК в 5 раз и в 40 раз, соответственно, больше, чем в исходном штамме. Поскольку продукция бактериальной тРНКf оказалась значительно выше, чем продукция ее архейного гомолога, мы предпочли нарабатывать для кристаллизации инициаторную тРНК E. сoli. Для получения очищенной инициаторной тРНК препарат суммарной тРНК фракционировали на колонке с ионообменной смолой MonoQ в линейном градиенте концентрации хлорида натрия. Эта методика позволяет с 1 литра культуры штамма-продуцента получать до 3 мг гомогенной тРНКf E. coli.

Рис. 10. Содержание рекомбинантных инициаторных тРНК в препаратах суммарной тРНК, полученных из штаммов-суперпродуцентов. Контроль – исходный штамм MRE600; MRE 600(Eco) – штамм-суперпродуцент для тРНКf E. coli; MRE 600(Sso) – штаммсуперпродуцент для тРНКi S.

solfataricus.

Реконструкция тройственного комплекса Met-тРНКf•SsoIF2D3•GDPNP и его кристаллизация Сборку тройственного комплекса Met-тРНКf•SsoIF2•ГТФ проводили из очищенных индивидуальных компонентов. Чтобы увеличить шансы на успех в получении кристаллов, решено было использовать для кристаллизации конформационно-стабильную сердцевинную часть фактора SsoIF2, состоящую из субъединицы и третьего домена -субъединицы (SsoIF2D3). Следует отметить, что SsoIF2D3 связывает инициаторную Met-тРНК с той же аффиностью, что и целый фактор [Yatime et al., 2004, 2006]. Делецию двух подвижных доменов SsoIFпроводили с помощью генно-инженерных методов, заменив кодон Glu174 на инициирующий ATG кодон. Выделение третьего домена SsoIF2 проводили по той же методике, что и выделение целой -субъединицы. Смешивая очищенные - и D3-субъединицы и применяя гель-фильтрацию, мы получали гомогенный препарат D3-гетеродимера.

Известно, что использование вместо ГТФ его негидролизуемых аналогов приводит к образованию более стабильного и долгоживущего тройственного комплекса, что крайне важно для кристаллизации. Мы использовали препарат GDPNP фирмы Sigma, который очищали от примеси ГДФ ионообменной хроматографией на MonoQ, а также препарат GDPCP фирмы Jena Bioscience, который не содержал примесей и не требовал дополнительной очистки. При кристаллизации комплекса и с тем и с другим аналогом были получены одинаковые результаты. Окончательно для кристаллизации был выбран комплекс с GDPNP.

Met-тРНКi в свободном состоянии спонтанно деаминоацилируется за короткое время. Поэтому все операции производили умерено быстро и на холоду. После реакции аминоацилирования Met-тРНКf депротеинизовали фенолом и осаждали этанолом. Осадок Met-тРНКf под спиртом можно хранить при – 70°С до месяца без потери активности. Обессоливание препарата Met-тРНКf проводили гельфильтрацией на сефадексе G25. Полученный водный раствор Met-тРНКf смешивали с SsoIF2D3, который предварительно инкубировали с одним из негидролизуемых аналогов ГТФ в молярном соотношении белок:нуклеотид равном 1:4. В свою очередь, молярное соотношение РНК:белок в реакционной смеси составляло 1.5:1.

Избыточное количество Met-тРНКf над белком брали из расчета, что не вся инициаторная тРНК находится в аминоацилированном состоянии. После 20-ти минутной инкубации препарат реконструированного тройственного комплекса наносили на колонку с супердексом-75, чтобы очистить тройственный комплекс от избытка свободной тРНКf и нуклеотида. Фракции, содержавшие по данным гельэлектрофореза комплекс Met-tRNAf•SsoIF2D3•GDPNP, объединяли, и тройственный комплекс осаждали добавлением сульфата аммония.

Рис. 11. Кристаллы тройственного комплекса Met-tRNAf•SsoIF2D3•GDPNP.

Первая форма (А); вторая форма кристаллов (Б).

Подбор условий кристаллизации методом диффузии паров в висящей капле вели при 12°C в присутствии сульфата аммония, используя коммерческий набор растворов Natrix для кристаллизации РНК-белковых комплексов. Были получены две формы кристаллов Met-tRNAf•SsoIF2D3•GDPNP. На рис. 11А представлены кристаллы, образующиеся из раствора тройственного комплекса с концентрацией 3 – 4 мг/мл в смешанном буфере Hepes-KOH c MES, рН 7.0, содержащем сульфат аммония в концентрации 28% насыщения, 7 мМ MgCl2, 0.5 мМ ДТТ, 0.2 мМ GDPNP. Размер кристаллов составлял 7050180 мкм. Вторая форма кристаллов (рис. 11Б) тройственного комплекса размером 60020040 мкм была получена из раствора комплекса с концентрацией 23 – 25 мг/мл в буфере какодилат-Na, pH 6.0, содержащем 0.68 М сульфата аммония, 6 мM ацетата магния, 7 – 10 мМ MgCl2, мМ GDPNP и 1 – 1.2 мМ CdCl2. Как видно из рисунка 11 во вторых условиях были получены значительно более крупные кристаллы Met-tRNAf•SsoIF2D3•GDPNP, но менее упорядоченные и на внешний вид слоистые. Предварительные кристаллографические исследования показали, что данные кристаллы отражают рентгеновские лучи с низким разрешением (до 7 – 8 ) и имеют высокую мозаичность, тогда как кристаллы, полученные в первых условиях, давали дифракционную картину с разрешением до 3.2. Кристаллы первой формы были использованы для сбора дифракционных данных на синхротроне в Берлине (линия BL2 станции BESSY II, Германия). В настоящее время совместно с группой С.В.

Никонова (ИБ РАН, Пущино) ведется работа по определению структуры тройственного комплекса Met-tRNAf•SsoIF2D3•GDPNP.

ВЫВОДЫ В настоящей диссертационной работе получены следующие основные результаты:

1. Получены штаммы-суперпродуценты E. coli для всех субъединиц белка aIF2 S.

solfataricus и инициаторных тРНК E. coli и S. solfataricus. Разработаны процедуры выделения данных макромолекул, а также гетеротримера SsoIF2 в препаративных количествах.

2. Получены кристаллы изолированной -субъединицы SsoIF2 в свободной форме и в комплексе с ГДФ и негидролизуемыми аналогами ГТФ, что позволило определить пространственные структуры этого белка в нескольких состояниях.

3. Показано, что нуклеотид-связывающий карман, расположенный на G-домене -субъединицы, обладает более высоким сродством к ГДФ, чем к негидролизуемому аналогу ГТФ.

4. Впервые обнаружен дополнительный сайт связывания ГТФ на -субъединице aIF2. Проверено предположение, что этот сайт может являться местом для взаимодействия 5-концевого гуанозин-трифосфата мРНК с -субъединицей:

показано, что добавление ГТФ или его негидролизуемых аналогов к -субъединице ингибирует ее связывание с мРНК, тогда как ГДФ подобного действия не оказывает.

5. Получены кристаллы интактного гетеротримерного SsoIF2, что позволило впервые определить и проанализировать полную структуру этого фактора.

Показано, что фактор aIF2 состоит из конформационно-стабильной сердцевинной части (-субъединица и 3 домен -субъединицы) и двух подвижных «крыльев» (1 и домены -субъединицы, центральная и С-концевая части -субъединицы).

6. Разработана методика реконструкции in vitro тройственного комплекса MettRNAf•SsoIF2D3•GDPNP. Выращены крупные кристаллы этого комплекса, с которых собраны дифракционные данные с разрешением до 3.2.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Столбоушкина E.A., Никонов O.С., Гарбер M.Б. (2009) Выделение и кристаллизация гетеротримерного фактора инициации трансляции 2 из Sulfolobus solfataricus. Биохимия 74(1), 70-77.

2. Stolboushkina E., Nikonov S., Nikulin A., Blsi U., Manstein D.J., Fedorov R., Garber M., Nikonov O. (2008) The crystal structure of the trimeric archaeal translation initiation factor 2 reveals very high conformational flexibility of the - and -subunits. J. Mol. Biol., 382, 680-691.

3. Nikonov O.S., Stolboushkina E.A., Nikulin A.D., Hasenhrl D., Blsi U., Manstein D.J., Fedorov R.V., Nikonov S.V., Garber M.B. (2008) New insights into the interactions of the translation initiation factor 2 from archaea with guanine nucleotides and initiator tRNA.

Abstract

book of the HHMI Meeting of International Research Scholars, Lisbon, Portugal, 19-22 June, 28.

4. Столбоушкина E.A., Никонов O.С., Никулин A.Д., Никонов С.В., Блэзи У., Гарбер M.Б. (2008) Кристаллизация и РНК-связывающие свойства архейного фактора инициации трансляции 2 (aIF2). Сборник тезисов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, Россия, 11-15 Май, 88.

5. Nikonov O., Stolboushkina E., Nikulin A., Hasenhrl D., Blsi U., Manstein D.J., Fedorov R., Garber M., Nikonov S. (2007) New insights into the interactions of the translation initiation factor 2 from archaea with guanine nucleotides and initiator tRNA. J.

Mol. Biol., 373, 328-336.

6. Stolboushkina E.A., Nikonov O.S., Nikulin A.D., Nikonov S.V., Garber M.B., Blsi U.

(2007) Crystallization of the heterotrimeric archaeal translation initiation factor aIF2. 40th Anniversary of the Institute of Protein Research Russian Academy of Sciences. Abstract book of the International Conference on «Protein Biosynthesis, Structure and function».

Pushchino, Russia, 9-13 June, 23.

7. Stolboushkina E., Zelinskaya N., Shepel E., Nikulin A., Nikonov O., Nikonov S., Garber M., Hasenhrl D., Blsi U. (2006) Translation initiation factor aIF2 from the archaeon Sulfolobus solfataricus. Abstract book of the FEBS Advanced Course «Advanced methods in macromolecular crystallization II». Nove Hrady, Czech Republic, 6-October, 212.

8. Столбоушкина E.A., Гуськов A.И., Никулин A.Д., Никонов С.В., Гарбер M.Б.

(2006) Пространственная структура -субъединицы гетеротримерного фактора инициации трансляции aIF2 из археи Sulfolobus solfataricus. Сборник тезисов 10-ой международной пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века». Пущино, Россия, 17-21 Апрель, 51.

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»