WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Известно, что при переходе из ГТФ- в ГДФ-связанное состояние в структуре EF-Tu происходит существенный сдвиг доменов 2 и 3 относительно домена 1, и одновременно с этим происходят скоординированные конформационные изменения в петлях-переключателях switch1 и switch2. При этом участки switch1 и switchпереходят из конформации «ON» в «OFF», а «тело» самого белка EF-Tu из активной «закрытой» конформации в «открытую» неактивную. Основываясь на сходстве структур -субъединицы с фактором элонгации EF-Tu, можно было ожидать, что происходят значительные конформационные изменения при переходе e/aIF2 из ГТФ- в ГДФ-связанную форму. Оказалось, однако, что -субъединица aIF2 во всех трех состояниях: свободном, ГТФ-связанном и ГДФ-связанном, принимает конформацию аналогичную «закрытой» ГТФ-связанной конформации EF-Tu, когда все три домена сближены друг с другом. Что касается зависимости конформации switch районов -субъединицы aIF2 от природы связанного нуклеотида, то такой четкой картины как в EF-Tu здесь не наблюдается, хотя некоторые изменения в конформации этих районов и просматриваются.

Гипотетическая модель взаимодействия инициаторной метионил-тРНК с фактором инициации трансляции В структуре SsoIF2•GDPNP/GDP, помимо ГДФ, были найдены также три молекулы пирофосфата. Один из этих пирофосфатов находится в щели между доменами II и III (рис. 6). Этот участок, при внимательном рассмотрении, оказался очень удобным стерически для расположения в нем акцепторного черешка тРНК.

Докинг к этому участку Met-тРНКi, взятой из структуры 70S рибосомы Thermus thermophilus [Selmer et al., 2006], привел к оригинальной модели (рис. 7Б) комплекса -димера aIF2 с инициаторной метионил-тРНК [Nikonov et al., 2007].

Рис. 7. Гипотетические модели комплексов тРНК•aIF2•ГТФ. А – EF-Tu подобная модель [Yatime et al., 2006]. Б – Модель, предложенная О.С. Никоновым, на основе наших структурных данных [Nikonov et al., 2007].

Эта модель принципиально отличается от ранее опубликованной модели данного комплекса [Yatime et al., 2006], которая, в сущности, повторяла известную структуру комплекса Phe-tRNAPhe•EF-Tu•GDPNP (PDB код 1ttt). Основываясь на структурной гомологии -субъединицы аIF2 с фактором элонгации EF-Tu, авторы вышеупомянутой модели провели наложение структуры тройственного комплекса Phe-tRNAPhe•EF-Tu•GDPNP на структуру -субъединицы в кристаллографической модели SsoIF2•GDPNP (рис. 7А). Данная модель не отвечает на два важных вопроса. Во-первых, каким образом отсутствие прямого контакта между субъединицей и тРНК может объяснить тот факт, что только в присутствии субъединицы, а именно ее третьего домена, инициаторная Met-тРНК образует стабильный комплекс с -субъединицей. Во-вторых, открытым остается вопрос, почему фактор инициации трансляции 2 специфически связывает только инициаторную Met-тРНК и не может взаимодействовать с элонгаторными тРНК.

Авторы предположили, что -субъединица опосредованно влияет на процесс связывания Met-тРНКi с -субъединицей aIF2, помогая каким-то образом субъединице, связанной с ГТФ, приобретать такие конформации в районах switch1 и switch2, при которых -субъединица становится способна образовывать стабильный комплекс с Met-тРНКi. Однако при сравнении конформаций switch1 и switch2 в структурах -субъединицы в свободном и нуклеотид-связанном состояниях в изолированном виде и в составе димеров с - и -субъединицами из S. solfataricus никаких специфических конформационных изменений в этих участках обнаружено не было.

В оригинальной модели, предложенной в нашей работе, ориентация акцепторного черешка тРНК перпендикулярна по отношению к таковой в модели, предложенной французской группой. В такой ориентации тРНК должна образовывать обширную зону контакта с -субъединицей, что объясняет стабилизацию тройственного комплекса. Более того, предложенная модель демонстрирует каким образом может осуществляться специфическое связывание тРНК: уникальный выступ на поверхности инициаторной тРНК, образованный двумя выпяченными нуклеотидами, стерически подходит к участку с вогнутой поверхностью на -субъединице. Конечно, хотя предложенная модель и удовлетворяет известным экспериментальным фактам, она является гипотетической и может быть подтверждена или опровергнута только при экспериментальном определении структуры тройственного комплекса. Кристаллы такого комплекса, пригодные к структурным исследованиям, были нами недавно получены (см. пункт 4).

Дополнительный сайт связывания ГТФ на -субъединице aIFСравнение карт электронной плотности для свободной от нуклеотида и сокристаллизованной со смесью GDP/GDPNP -субъединицы привели к неожиданному обнаружению молекулы GDPNP на поверхности одной из двух молекул -субъединицы, содержащихся в асимметричной части элементарной ячейки кристалла. Оказалось, что наряду с ГДФ, расположенном в каноническом нуклеотид-связывающем кармане белка, одна из молекул -субъединицы содержит GDPNP в районе домена II (рис. 6). Это место, назовем его неканоническим нуклеотид-связывающим карманом, расположено между доменами I(G) и II и образовано тяжами 7, 8, 11, 14, петлей 11–12 и остатками 40 – 45 петли switch1. Молекула GDPNP завязывает водородные связи с Asp222 и Arg280 домена II и Glu40 петли switch1. Во второй молекуле -субъединицы указанный неканонический ГТФ-связывающий сайт претерпел конформационные изменения, которые не позволили связаться нуклеотиду. Аминокислотный остаток Metзакрывает этот сайт, формируя водородную связь с Lys225 и гидрофобное «пятно» вместе с Phe221, Val223, Val237.

Связывание GDPNP в дополнительном месте на -субъединице можно было бы расценить как артефакт, обусловленный кристаллизацией и особенностями данного нерасщепляемого аналога, содержащего перед ()-фосфатом NH группу, которая образует водородную связь с кислородом Asp222 в главной цепи белка.

Поэтому для подтверждения существования на -субъединице второго сайта связывания ГТФ были получены кристаллы и определена структура SsoIF2 в комплексе с другим нерасщепляемым аналогом ГТФ – GDPCP, который не содержит NH группу перед ()-фосфатом, и следовательно, не способен образовать дополнительную водородную связь (структура определена с разрешением 2.5, PDB код 3i1f).

Как и в структуре, полученной сокристализацией SsoIF2 со смесью GDPNP/GDP, в структуре комплекса SsoIF2•GDPCP неканонический нуклеотидсвязывающий сайт сформирован -листом домена II ( 7, 8, 12, 13) и мобильным участком switch1 G домена (остатки 41 – 44). Сравнение аминокислотных последовательностей белков семейства eEF1А показало, что участок структуры, формирующий неканонический сайт связывания нуклеотида на поверхности субъединицы, образован консервативными и высоко консервативными аминокислотными остатками, часть из которых образует сеть водородных связей с нерасщепляемым аналогом ГТФ. Это также говорит в пользу существования второго сайта связывания ГТФ в -субъединице aIF2.

Влияние гуаниновых нуклеотидов на связывание SsoIF2 с мРНК.

Гипотетический сайт связывания 5'-конца мРНК на поверхности -субъединицы Имеет ли второй сайт связывания ГТФ на -субъединице aIF2 функциональное значение Ранее нашими австрийскими коллегами была установлена дополнительная функция -субъединицы SsoIF2 похожая на ту, которую выполняет кэп-связывающий фактор eIF4E у эукариот [Hasenohrl et al., 2008]. Они обнаружили, что свободная от нуклеотида SsoIF2 связывает мРНК и защищает их от 5'3' направленной нуклеолитической деградации. Причем в качестве субстрата может выступать любая мРНК, на 5'-конце которой находится трифосфат (моно- и дефосфорилированные по 5'-концу мРНК не связываются с -субъединицей aIF2). В работе наших коллег были использованы мРНК, полученные исключительно транскрипцией in vitro с использованием Т7-РНК-полимеразы. Известно, что характерной чертой подавляющего большинства промоторов фаговых РНКполимераз является использование ГТФ в качестве первого нуклеозид-трифосфата при синтезе РНК. Более того, 5'-концевыми нуклеозидами в природных мРНК чаще всего являются пуриновые нуклеозиды (G или А). Мы предположили, что сайтом для узнавания является не просто трифосфат, а гуанозин-5-трифосфат на 5'-конце мРНК и обнаруженный неканонический участок связывания GDPNP в нашей структуре SsoIF2 есть то самое место, с которым взаимодействует 5'-конец мРНК.

В таком случае, добавление ГТФ или его негидролизуемых аналогов к субъединице должно было бы ингибировать ее связывание с мРНК.

Чтобы проверить это предположение, была проведена серия экспериментов по взаимодействию aIF2 и его субъединиц с 5'-концевыми фрагментами мРНК в присутствии различных нуклеотидов. В работе были использованы три фрагмента мРНК, полученных транскрипцией in vitro: SsoACATмРНК-30, MvaL1мРНК-36 и MjaL1мРНК-49. (Структуры двух последних фрагментов мРНК, закристаллизованных в комплексе с архейным рибосомным белком L1, были ранее определены в нашей лаборатории). В первой серии опытов мы исследовали влияние гуаниновых нуклеотидов на связывание изолированной -субъединицы с мРНК, смешивая компоненты в эквимолярных соотношениях и в разной последовательности. В первом варианте, мРНК добавляли к -субъединице, преинкубированной с одним из нуклеотидов ГДФ, ГТФ, GDPNP, GDPCP, а во втором – нуклеотид смешивали с -субъединицей, преинкубированной с мРНК.

Наличие в реакционной смеси РНК-белковых комплексов регистрировалось с помощью электрофореза в неденатурирующих условиях (методом гель-шифта).

Из результатов экспериментов, приведенных на рис. 8А, видно, что в случае предварительной инкубации -субъединицы с ГТФ или его аналогами комплексообразование между мРНК и белком подавляется, тогда как ГДФ подобного эффекта не оказывает и во всех случаях комплекс -субъединицы с мРНК образовывается. В то же время, добавление ГТФ, GDPNP или GDPCP к ранее образованному мРНК-белковому комплексу не приводит к его разрушению. Для остальных выбранных нами фрагментов мРНК были получены идентичные результаты. Следует отметить, что в присутствии АТФ, УТФ или ЦТФ образование комплекса между мРНК и -субъединицей не ингибировалось ни одним из использованных нуклеотидов (данные не представлены).

Рис. 8. А, Б – Электрофоретический анализ взаимодействия -субъединицы SsoIF2 с MjaL1мРНК49 в присутствии гуаниновых нуклеотидов (в 3%-ном агарозном геле в неденатурирующих условиях).

1А – мРНК; 2А – SsoIF2•мРНК; 3А – [SsoIF2•ГТФ]+мРНК; 4А – [SsoIF2•мРНК]+ГТФ; 5А – [SsoIF2•ГДФ]+мРНК; 6А – [SsoIF2•мРНК]+ГДФ;

7А – [SsoIF2•GDPCP]+мРНК; 8А – [SsoIF2•мРНК] +GDPCP; 9А – [SsoIF2•GDPNP]+мРНК; 10А – [SsoIF2•мРНК]+GDPNP; 1Б – мРНК; 2Б – [SsoIF2•ГДФ (1:10)] + мРНК; 3Б – [SsoIF2•мРНК] + десятикратный избыток ГДФ; 4Б – SsoIF2 + смесь [мРНК + ГТФ]; 5Б – [SsoIF2•ГДФ (1:10)] + смесь [мРНК + ГТФ]; 6Б – [[SsoIF2•ГДФ (1:10)] + ГТФ] + мРНК; 7Б – [[SsoIF2•ГДФ (1:10)] + мРНК] + ГТФ.

За исключением десятикратного избытка ГДФ в дорожках 2Б, 3Б, 5Б, 6Б, 7Б, во всех остальных случаях в реакционной смеси использовали эквимолярные количества нуклеотида, мРНК и белка.

Из полученных данных следует, что связывание ГТФ и мРНК с субъединицей есть взаимоисключающее событие: связывание того или другого субстрата зависит от порядка их прибавления к белку. Это в свою очередь указывает на то, что оба субстрата реагируют с идентичным местом на -субъединице.

Причем, ГТФ избирательно связывается с -субъединицей и не может быть заменен ни другими нуклеозид-трифосфатами, ни гуанозин-5-дифосфатом. Однако он может быть заменен негидролизуемыми аналогами ГТФ – GDPNP или GDPCP. Это значит, что мы имеем дело с неканоническим нуклеотид-связывающим сайтом, с которым ГДФ не взаимодействует, а избирательно связывается гуанозин-5-трифосфат на 5'конце мРНК.

Для дополнительного подтверждения данного утверждения, вышеописанные опыты были повторены с SsoIF2, преинкубированной с десятикратным избытком ГДФ (рис. 8Б). При такой постановке эксперимента канонический нуклеотидсвязывающий сайт на -субъединице должен быть занят ГДФ, что позволяет проверить конкуренцию между мРНК и ГТФ за связывание со вторым – неканоническим нуклеотид-связывающим сайтом. Из рисунка 8Б видно, что ГДФ не подавляет образования комплекса между мРНК и белком даже при десятикратном избытке (дорожки 2, 3). В то же время, в присутствии в реакционной смеси десятикратного избытка ГДФ эквимолярное по отношению к белку количество ГТФ ингибирует образование мРНК-белкового комплекса (дорожка 6). Эти эксперименты показывают также, что мРНК и ГТФ взаимодействуют с SsoIF2 с одинаковым сродством и ни мРНК, ни ГТФ не в состоянии вытеснить друг друга из комплекса с -субъединицей (дорожки 4, 5, 7). Рисунок 8Б (дорожка 4) показывает, что одновременное прибавление к белку ГТФ и мРНК приводит к связыванию обоих субстратов в равной пропорции, причем, присутствие десятикратного избытка ГДФ не влияет на результат (дорожка 5). Анализ структуры позволяет предположить, что связавшийся с неканоническим сайтом ГТФ запирается изменившим свою конформацию участком switch1. Этот участок switch1 может работать как «замок», который не позволяет ни одному из субстратов вытеснить конкурентную молекулу, связанную в неканоническом сайте. Таким образом, эксперименты по конкурентному связыванию позволяют сделать вывод, что трифосфат на 5'-конце мРНК узнается неканоническим нуклеотид-связывающим сайтом, расположенным между доменами I и II aIF2.

Во второй серии опытов мы решили проверить действие ГТФ на мРНКсвязывающие свойства гетеродимеров и и и целого гетеротримерного фактора SsoIF2 и получили интересные результаты. Для этого в эквимолярных соотношениях гетеротример или гетеродимеры предварительно инкубировали с ГТФ, а потом смешивали с мРНК. Заведомо известно, что РНК-белковые комплексы несут отрицательный заряд на своей поверхности. Комплекс SsoIF2•мРНК является исключением из правил и заряжен положительно, по-видимому, в силу более основной природы SsoIF2 (pI 9.2) по сравнению с остальными субъединицами.

Поэтому в работе с полным фактором SsoIF2 использовали горизонтально расположенные пластины геля, позволяющие визуализировать РНК-белковые комплексы, миграция которых происходит к катоду. Из рисунка 9 видно, что по сравнению с изолированной -субъединицей, добавление ГТФ к SsoIF2 не приводит к полному ингибированию его связывания с мРНК. Димер в присутствии ГТФ перестает ассоциировать с мРНК, тогда как -димер, подобно целому фактору SsoIF2, частично сохраняет связывание с мРНК. В то же время, делеция двух подвижных доменов -субъединицы в -димере исключает связывание его с мРНК при наличии ГТФ. Однако сама по себе -субъединица не взаимодействует с мРНК, даже в условиях двадцатикратного избытка.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»