WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Анализ причин невоспроизводимости кристаллов показал, что белок в растворе с течением времени агрегирует, а примесь даже небольшого количества агрегатов ингибирует кристаллизацию. Можно было убрать агрегаты гель-фильтрацией и получить гомогенный препарат SsoIF2, который начинал кристаллизоваться, но после непродолжительного времени в растворе снова появлялись белковые агрегаты. Мы предположили, что агрегация SsoIF2 связана с окислением SH-групп белка и образованием межмолекулярных S-S–связей, и стали добавлять в буферные растворы -меркаптоэтанол или ДТТ на всех стадиях выделения SsoIF2, а по окончании очистки препарат белка либо сразу переводили в условия кристаллизации, либо замораживали в жидком азоте и хранили при – 70°С.

После отработки условий выделения и хранения кристаллизуемых препаратов SsoIF2 мы приступили к оптимизации условий его кристаллизации.

Перспективными условиями для получения кристаллов пригодных для рентгеноструктурного анализа оказались те, в которых осаждающий реагент состоял из формиата натрия и смеси полиэтиленгликолей. Появление кристаллов сильно зависело от pH раствора. Белок кристаллизовался только при pH 8.5, т. е. вблизи своей изоэлектрической точки. Оптимальная концентрация белка в капле была 10 – 12 мг/мл, а температура 22°С. Решающим фактором для появления крупных кристаллов SsoIF2 оказалось добавление в кристаллизационную смесь ММЭПЭГ 5000 до конечной концентрации 1%. Следует отметить, что от выделения к выделению препараты SsoIF2 отличались по способности образовывать высокоупорядоченные одиночные кристаллы. Наилучшие по качеству кристаллы были получены из объединенных фракций со склонов пика SsoIF2 при хроматографии на колонке с гепарин-сефарозой. Такие кристаллы (рис. 3) были получены только один раз, они отражали рентгеновские лучи с разрешением до 2. и были использованы для сбора дифракционных данных.

Набор дифракционных данных, использовавшийся для определения кристаллической структуры, был собран на синхротроне в Гамбурге (линия Xстанции DESY, Германия) при температуре 100°К. Непосредственно перед заморозкой в струе жидкого азота кристаллы SsoIF2 переносили в криораствор.

Криораствор содержал следующие компоненты: 15%-ный этиленгликоль, 80 мМ Tris-HCl, pH 8.5, 600 мМ формиат натрия, 7.5 %-ный ПЭГ 8000, 7.5 %-ный ПЭГ 1000, 1 %-ный ММЭПЭГ 5000. Кристаллы SsoIF2 принадлежат к пространственной группе Р21 с параметрами элементарной ячейки a = 79.2, b = 162.92, c = 161., = = 90°, = 90.04°. Ассиметричная часть элементарной ячейки содержит четыре молекулы SsoIF2.

Рис. 3. Кристаллы белка SsoIF2, полученные в присутствии 0.05 M Tris-HCl, pH 8.5, 0.36 M формиата натрия, 4.5%-ного ПЭГ 8000, 4.5%-ного ПЭГ 1000, 1%-ного ММЭПЭГ 5000, появлялись через 2 – 3 дня и росли в течение недели до размеров 60020040 мкм.

Работа по решению и анализу структуры SsoIF2 проводилась совместно с группой С.В. Никонова (ИБ РАН, Пущино). Фазовая проблема решалась методом молекулярного замещения. Процесс решения включал два этапа. Вначале в качестве стартовой поисковой модели использовали определенную нами ранее структуру SsoIF2, в результате чего удалось получить модель -димера, которая затем использовалась для поиска положения -субъединицы в структуре полного гетеротримера. Поиск положения -субъединицы SsoIF2 значительно осложнялся из-за твиннинга кристаллов. С помощью программы PHENIX была получена электронная плотность для целой -субъединицы, но только для двух из четырех молекул SsoIF2. Для остальных двух молекул SsoIF2 в ассиметричной части элементарной ячейки карту электронной плотности смогли построить только для Nконцевой -спирали -субъединицы. Таким образом, окончательная модель SsoIFвключает по четыре молекулы - и -субъединиц, две молекулы -субъединицы и две N-концевых -спирали SsoIF2, что в целом соответствует аминокислотным остаткам. Координаты атомов данной модели занесены в банк белковых структур (PDB код 3cw2). Следует отметить, что у одной из четырех молекул -субъединицы отсутствует электронная плотность для аминокислотных остатков с 36 по 45, которые соответствуют району петли switch1. Кроме того, ни в одном из цинк-связывающих мотивов - и -субъединиц не обнаружено атомов цинка. В результате С-концевые домены -субъединиц в нашей структуре SsoIFслабо структурированы, а Cys109 в одной из молекул -субъединицы образует дисульфидный мостик с Cys127, тогда как Cys109 второй молекулы -субъединицы завязывает водородную связь с Glu25. В целом доменная организация -, -, субъединиц SsoIF2 схожа с ранее описанными в литературе структурами субъединиц фактора инициации трансляции 2.

Общими очертаниями молекула SsoIF2 напоминает английскую букву L, длинное плечо которой образовано -субъединицей, короткое – -субъединицей, а угол – -субъединицей (рис. 4). Подвижные и функционально значимые участки субъединицы, петли-переключатели switch1 и switch2, расположены у внутреннего угла L-образной молекулы SsoIF2, между - и -субъединицами. Центральная субъединица взаимодействует с двумя другими субъединицами, тогда как - и субъединицы SsoIF2 между собой не контактируют. G-домен -субъединицы связывает N-концевую -спираль и С-концевой цинк-связывающий домен субъединицы, а второй домен -субъединицы взаимодействует с третьим доменом -субъединицы. Полученный нами результат находится в хорошем соответствии с данными по структуре -димера и неполного гетеротримера [Yatime et al., 2004;

Pedulla et al., 2005, Yatime et al., 2006; 2007]. Имеется, однако, различие со структурой -димера P. furiosus, где -субъединица взаимодействует не с Сконцевым, а с центральным доменом -субъединицы [Sokabe et al.,2006].

Рис. 4. Схематическое изображение пространственной структуры SsoIF2 (PDB код 3cw2). Римскими цифрами обозначены домены.

Петли switch1 и switch2 обозначены как sw1 и sw2, соответственно.

Между - и -субъединицами SsoIF2 образуются две области контактов, расположенные друг от друга на расстоянии 12. Одна из них содержит три водородные связи, в результате которых формируется антипараллельный -лист, сложенный из тяжей 6, 7, 8 -субъединицы и 7-тяжа -субъединицы. Второй участок связывания включает две водородные связи, образованные петлей 7–8 и N-концевой частью 6-спирали -субъединицы и петлей 13–6 -субъединицы. В свою очередь -субъединица формирует тоже два межсубъединичных интерфейса с -субъединицей SsoIF2 площадью 1135 2 (между 1-спиралью -субъединицы и участком -субъединицы, содержащим петли 5–4, 4–6, 4-спираль и 6-тяж) и 376 2 (между участком С-концевого домена -субъединицы, остатки 134 – 139 и Nконцевой частью switch1 и петли 2–3 -субъединицы). Области указанных контактов между - и -субъединицами стабилизированы водородными связями и гидрофобными взаимодействиями. Следует отметить, что в изолированном состоянии -субъединица имеет неструктурированную N-концевую часть, которая приобретает -спиральную структуру, по-видимому, при связывании с субъединицей. Эта N-концевая -спираль содержит высококонсервативные аминокислотные остатки, которые важны для узнавания и связывания субъединицы. Четыре молекулы гетеротримера SsoIF2, расположенные в ассиметричной части кристалла, хотя и эквивалентны по структуре, но не идентичны. Наиболее нестабильную структуру имеет -субъединица. Во всех четырех молекулах -субъединицы конформации функционально-важных switch участков несколько отличаются друг от друга.

Чтобы проанализировать конформационную гибкость и взаимное расположение субъединиц в гетеротримере, было проведено наложение всех известных структур этих субъединиц на структуру гетеротримера. Субъединицы e/aIF2 накладывались по третьему домену, который жестко связан с субъединицей. Оказалось, что домены 1 и 2 aIF2 очень подвижны и могут свободно вращаться в плоскости, расположенной под углом около 120 относительно длинной оси домена 3. Следует отметить, что в первом домене -субъединицы aIFрасположен Ser48, который в пространстве занимает положение аналогичное положению Ser51 эукариотической -субъединицы. Известно, что фосфорилирование Ser51 приводит к ингибированию синтеза белка в клетках эукариот. В археях роль второго фактора инициации трансляции в регуляции трансляции не определена, но показано, что Ser48 в aIF2 фосфорилируется эукариотической дцРНК-зависимой киназой PKR, активируемой при вирусной инфекции, а также е архейным гомологом, обозначенным как Ph0512p [Tahara et al., 2004]. Благодаря тому, что первый и второй домены -субъединицы свободно вращаются на угол 180° относительно ее третьего домена, смещение участка фосфорилирования может достигать 90. Пока неизвестно, имеет ли такая подвижность сайта фосфорилирования -субъединицы функциональное значение.

Районы aIF2, контактирующие с aIF2 в структуре гетеродимера aIF2 и двух структурах гетеротримера (неполноразмерного и интактного aIF2), накладывались друг на друга, чтобы найти соответствующие позиции aIF2.

Оказалось, что только N-концевая -спираль aIF2 (остатки 7 – 16) сохраняет свои позиции в трех структурах. Конформации центральной части и цинк-связывающего домена aIF2 отличаются во всех рассмотренных структурах.

Таким образом, по нашим данным фактор инициации трансляции 2 можно рассматривать как молекулу, состоящую из конформационно-стабильной центральной части и двух подвижных «крыльев». Центральная часть включает в себя -субъединицу, третий домен -субъединицы и N-концевую -спираль субъединицы, а «крылья» – первый и второй домены -субъединицы, с одной стороны, и центральный и С-концевой домены -субъединицы, с другой стороны.

По-видимому, такая высокая внутримолекулярная подвижность фактора инициации трансляции 2 необходима для его функционирования. Другими словами, такая гибкость молекулы позволяет белку менять свое сродство к лигандам и обеспечивает переход белка из одного состояния в другое.

3. Кристаллизация и исследования структуры и свойств -субъединицы SsoIFКристаллизация и исследования структуры -субъединицы SsoIFПомимо полноразмерного гетеротримера SsoIF2, нами были получены также кристаллы изолированной -субъединицы этого фактора. Мы кристаллизовали субъединицу как в свободной (рис. 5А), так и в нуклеотид-связанной (рис. 5Б) формах. Кристаллы -субъединицы SsoIF2 в комплексе с нуклеотидами были получены сокристаллизацией белка с десятикратным избытком коммерческого препарата нерасщепляемого аналога ГТФ – GDPNP. Мы ожидали увидеть в нуклеотид-связывающем кармане белка именно этот нуклеотид, однако, к своему удивлению обнаружили там ГДФ. Проверка качества использовавшегося нами коммерческого препарата GDPNP показала, что он содержал до 30% примеси ГДФ.

Кристаллы свободной и нуклеотид-связанной -субъединицы SsoIF2 были получены в одних и тех же условиях, используя малонат натрия, pH 4.5, и хлорид кадмия в качестве добавки. Добавление в кристаллизационный раствор хлорида кадмия позволяло увеличить размеры и улучшить качество кристаллов.

Рис. 5. А – Кристаллы свободной от нуклеотида SsoIF2. Б – SsoIF2, сокристаллизованная со смесью GDPNP/GDP. Кристаллы -субъединицы в обоих функциональных состояниях появлялись через 2 дня и росли до размеров 450100100 мкм.

Сбор дифракционных данных с кристаллов производили на синхротроне в Гамбурге (линия X12 станции DESY, Германия). Кристаллы свободной и сокристаллизованной со смесью GDPNP/GDP SsoIF2 принадлежат к разным пространственным группам Р3121 (a = b = 94.84, c = 166.43, = = 90°, = 120°) и Р31 (a = b = 95.06, c = 165.67, = = 90°, = 120°), соответственно.

Ассиметричная часть элементарной ячейки кристалла SsoIF2 содержит одну молекулу белка, тогда как в кристалле нуклеотид-связанной SsoIF2 – две молекулы белка в асимметричной части элементарной ячейки, связанные между собой осью симметрии второго порядка. Структуры свободной и нуклеотид-связанной SsoIFбыли определены методом молекулярного замещения с разрешением 2.9 и 2.65, соответственно. В качестве модели использовали структуру -субъединицы в составе гетеродимера SsoIF2•GDPNP-Mg2+ (PDB код 2aho), определенную ранее французской группой [Yatime et al., 2006]. Несмотря на то, что кристаллизация SsoIF2 со смесью нуклеотидов GDPNP/GDP проводилась в присутствии хлорида магния, тем не менее, ион магния вблизи места связывания фосфатного остатка нуклеотида в определенной нами структуре не обнаружен. Атом цинка в цинксвязывающих участках белка также не был найден. Ассиметричная часть элементарной ячейки содержит две молекулы белка, на каждую из которых приходится по одной молекуле ГДФ и по три молекулы пирофосфата. В одной из молекул белка был обнаружен также и аналог ГТФ – GDPNP (рис. 6), поэтому мы можем обозначать данную структуру как SsoIF2•GDPNP/GDP. Координаты атомов обоих моделей SsoIF2 и SsoIF2•GDPNP/GDP занесены в банк белковых структур (PDB код 2plf и 2pmd, соответственно).

e/aIF2 является рибосомозависимой ГТФазой и по своей структуре относится к семейству белков eEF1А (EF-Tu). Общая доменная организация SsoIF2 и SsoIF2•GDPNP/GDP схожа с таковой в опубликованных ранее структурах субъединицы, а также с доменной организацией фактора элонгации EF-Tu в его ГТФ-связанной форме. Все домены G, II и III пространственно сближены, что соответствует «закрытой» ГТФ-связанной активной форме EF-Tu. Структуры SsoIF2 и SsoIF2•GDPNP/GDP хорошо совпадают между собой, за исключением локальных конформационных изменений вокруг нуклеотид-связывающего кармана и switch участков.

Рис. 6. Иллюстрация трехмерной структуры SsoIF2•GDPNP/GDP. Римскими цифрами обозначены домены.

Несмотря на то, что к тому времени, как нами была определена структура субъединицы SsoIF2, уже было известно несколько структур этой субъединицы из различных организмов, анализ нашей структуры SsoIF2 привел к интересным и неожиданным результатам. Во-первых, исходя из литературных биохимических данных об одинаковом сродстве архейной -субъединицы фактора инициации трансляции 2 к ГДФ и ГТФ [Pedulla et al., 2005], можно было ожидать, что в нуклеотид-связывающем кармане белка свяжется аналог ГТФ, концентрация которого в использовавшемся для сокристаллизации препарате была вдвое выше, чем концентрация ГДФ. Однако в нуклеотид-связывающем кармане в обеих молекулах SsoIF2 в ассиметричной части ячейки кристалла был обнаружен ГДФ.

Это прямое свидетельство в пользу большего сродства -субъединицы aIF2 к ГДФ, чем к ГТФ или, по крайней мере, к нерасщепляемому аналогу ГТФ – GDPNP.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»