WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

СТОЛБОУШКИНА ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ АРХЕЙНОГО ФАКТОРА ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ 2 03.00.03 – Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2009

Работа выполнена в Институте белка РАН

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Гарбер Мария Борисовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Фролова Людмила Юрьевна доктор химических наук Шатский Иван Николаевич

Ведущая организация:

Филиал Института биооpганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Защита состоится « 13 » ноября 2009 года в 12 часов на заседании совета Д 501.001.76. по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу:

119992, Москва, ГСП-2, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан « 28 » сентября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук И.А. Крашенинников 1

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Инициация биосинтеза белка на рибосоме – важнейший этап в реализации генетической информации и клеточной регуляции.

Это сложное многоэтапное событие, в котором участвуют различные белковые факторы, молекулы РНК и низкомолекулярные соединения. Наименее изучен механизм инициации трансляции у архей. Чтобы разобраться в этом сложном процессе необходимо знание функциональной роли и структурной организации белковых факторов инициации трансляции. Ключевую роль в процессе инициации биосинтеза белка у архей играет гетеротримерный фактор инициации трансляции 2 (aIF2), который осуществляет доставку инициаторной метионил-тРНК в Ручасток малой рибосомной субчастицы и гомологичен эукариотическому фактору eIF2. Кроме этого, архейная -субъединица aIF2 имеет неканоническую функцию:

защищает мРНК, на 5'-конце которых находится трифосфат, от 53 направленной деградации. Исследования структуры e/aIF2 очень актуальны ввиду важности его функции. Такие исследования в последние годы ведутся интенсивно в лабораториях ряда стран.

Цель работы: исследование структуры aIF2 из гипертермофильной археи Sulfolobus solfataricus (SsoIF2).

Основные задачи работы:

– получение штаммов-суперпродуцентов Escherichia coli для всех субъединиц белка SsoIF2 и инициаторных тРНК E. coli и S. solfataricus и разработка методов выделения данных макромолекул из клеток штаммов-суперпродуцентов, – получение гетеротримера SsoIF2, – разработка метода сборки тройственного комплекса Met-tRNAf•SsoIF2D3•GDPNP in vitro из индивидуальных компонентов, – кристаллизация -субъединицы SsoIF2 в нескольких функциональных состояниях (в свободной форме и в комплексе с ГДФ и негидролизуемыми аналогами ГТФ), интактного гетеротримерного SsoIF2 и тройственного комплекса Met-tRNAf•SsoIF2D3•GDPNP, – экспериментальная проверка предположения о том, что дополнительный сайт связывания ГТФ на -субъединице SsoIF2 является местом для взаимодействия 5концевого гуанозин-трифосфата мРНК.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые были получены кристаллы полноразмерного архейного фактора инициации трансляции 2, на основе которых была определена его пространственная структура. Анализ этой структуры выявил высокую подвижность в - и -субъединицах данного фактора.

Определение структуры изолированной -субъединицы SsoIF2 в различных состояниях привело к выдвижению оригинальной модели взаимодействия aIF2 с инициаторной метионил-тРНК и к обнаружению дополнительного, ранее никем не обнаруживавшегося, сайта связывания ГТФ на поверхности белка. Этот дополнительный ГТФ-связывающий сайт, согласно проведенным в данной работе экспериментам, может являться местом для взаимодействия 5-концевого гуанозинтрифосфата мРНК. Также впервые в данной работе получены кристаллы тройственного комплекса Met-tRNAf•SsoIF2D3•GDPNP.

Результаты по структуре гетеротримерного фактора инициации трансляции и по структурам комплексов -субъединицы aIF2 с нуклеотидами имеют фундаментальный характер и могут быть включены в курсы лекций по молекулярной биологии, читаемых на биологических факультетах различных ВУЗов. В методическом аспекте данная работа будет полезна для специалистов, работающих в области препаративной биохимии и кристаллизации макромолекул, как в нашей стране, так и за рубежом. Штаммы-суперпродуценты E. coli для всех субъединиц белка SsoIF2 и инициаторной тРНК E. coli, полученные в данной работе, используются в ИБ РАН. Препарат фактора SsoIF2 предоставлен для функциональных исследований в НИИ физико-химической биологии им. А.Н.

Белозерского.

Структура диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работу иллюстрируют 31 рисунков и 5 таблиц. Общий объем диссертации 119 страниц. Библиография включает 237 названий.

Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи. Результаты данной работы докладывались на Российских и международных конференциях.

Обзор литературы посвящен структурным и функциональным особенностям второго фактора инициации трансляции эукариотического типа.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Выделение гетеротримерного фактора SsoIF2 и его субъединиц С 2002 года в печати стали появляться структуры отдельных субъединиц фактора инициации трансляции 2 как эукариотического так и архейного происхождения. Четыре года назад мы подключились к этим исследованиям и приступили к выделению и кристаллизации aIF2 из гипертермофильной археи S.

solfataricus. Ранее SsoIF2 и его изолированные субъединицы никем не выделялись в препаративных количествах, поэтому нам пришлось разрабатывать собственные методики. Доктором У. Блэзи (Венский биоцентр, Австрия) нам были предоставлены плазмиды, содержащие гены субъединиц SsoIF2. С этих плазмид можно было получить субъединицы SsoIF2 с олигогистидиновыми «хвостами» на Сконцах. Мы переклонировали гены субъединиц SsoIF2 в экспрессионные векторы без нуклеотидной последовательности для олигогистидинового «хвоста».

Экспрессию клонированных генов проводили в клетках E. coli штамм BL21(DE3). В отличие от - и -субъединиц, синтез -субъединицы наблюдался на низком уровне.

Этот белок смогли наработать только в клетках штамма С41(DE3), предназначенного для продукции токсичных белков, причем продукция белка была настолько низкой, что идентифицировать его удалось только с помощью массспектрометрии. Поэтому для получения -субъединицы SsoIF2 в препаративных количествах нам пришлось выращивать культуру клеток штамма-суперпродуцента в большом объеме.

Общая схема выделения субъединиц SsoIF2 из клеток штаммовсуперпродуцентов E. coli изображена на рис. 1А. Очистка термостабильных субъединиц SsoIF2 была существенно облегчена тем, что прогрев белковых экстрактов при 65°С приводил к денатурации и выпадению в осадок большей части белков клетки-хозяина. После этой процедуры субъединицы SsoIF2 очищали всего лишь в две стадии колоночной хроматографии (рис. 1Б). Как правило, выделение белка из клеток суперпродуцента осложняется его неспецифическим взаимодействием с нуклеиновыми кислотами в клеточном экстракте. В растворах с высокой ионной силой возможно разрушение таких ассоциатов. Поэтому для очистки всех субъединиц SsoIF2 использовали гидрофобную хроматографию, которая позволяет связать белок с носителем при высоких концентрациях солей.

Включение в схему выделения катионообменной хроматографии обусловлено щелочной природой субъединиц. Расчетные изоэлектрические точки (pI) для субъединиц SsoIF2 лежат в пределах 8.3 – 9.2. Обычно белки оказываются достаточно заряженными и хорошо сорбируются на обменник при значениях рН, отличающихся от pI примерно на единицу. Для работы мы использовали буфер с рН 7.5. Однако -субъединица при таком значении рН не задерживалась на катионообменнике и свободно проходила через колонку, что скорее всего обусловлено недостаточно выраженным положительным зарядом белка. Между тем при сдвиге значения рН буфера в кислую сторону нам не удавалось полностью сорбировать -субъединицу на катионообменник. Поэтому для очистки субъединицы мы провели повторно гидрофобную хроматографию и добились этим желаемой чистоты препарата. Описанные в данной работе методики выделения изолированных субъединиц SsoIF2 позволяют получать из 1 л культуры до 10 мг белка (в случае -субъединицы только 2 мг) с чистотой не менее 95% (рис. 1В).

разрушение биомассы разрушение биомассы А Б Название Название Название А Б Название Название Название субъединицы носителя для носителя для субъединицы носителя для носителя для суперпродуцента суперпродуцента SsoIF2, хроматографии хроматографии SsoIF2, хроматографии хроматографии выделенной №1 №выделенной №1 №из биомассы из биомассы осаждение дебриса осаждение дебриса суперпродуцента суперпродуцента дебрис дебрис ButylButyl или D3 S-сефароза Toyopearl или D3 S-сефароза Toyopearl прогрев клеточного экстракта (65°) прогрев клеточного экстракта (65°) (в случае выделения -субъединицы – 650S (в случае выделения -субъединицы – 650S предварительное удаление рибосом) предварительное удаление рибосом) Butyl- ButylButyl- Butyl Toyopearl Toyopearl Toyopearl Toyopearl осаждение денатурированных белков осаждение денатурированных белков 650S 650S 650S 650S осадок осадок денатурированных Butyl- КМ-сефароза денатурированных Butyl- КМ-сефароза белков белков Toyopearl Toyopearl 650S 650S хроматография №хроматография № В В хроматография №хроматография №Рис. 1. А – Схема выделения изолированных субъединиц SsoIF2 из клеток штаммовсуперпродуцентов E. coli. Б – Таблица стадий хроматографической очистки изолированных субъединиц SsoIF2. В – Электрофоретический анализ (в 15%-ном ДДС-Na-ПААГ) чистоты препаратов изолированных субъединиц SsoIF2, полученных на конечной стадии хроматографической очистки.

Полноразмерный SsoIF2 можно получить, если смешать очищенные заранее субъединицы, а затем провести гель-фильтрацию реконструированного гетеротримера. Недостатки такого подхода – многостадийность и невысокий выход SsoIF2, недостаточный для широкого поиска условий кристаллизации. В 2006 году была опубликована более эффективная методика получения и очистки рекомбинантного aIF2 S. solfataricus [Yatime et al., 2006]. Авторы смешивали клетки штаммов-суперпродуцентов субъединиц в равных количествах, разрушали, дебрис удаляли, клеточный лизат прогревали и фракционировали на смолах S-сефароза и супердекс-75. Преимуществом такой методики является то обстоятельство, что сборка и очистка aIF2 происходит с самого начала и это обуславливает достаточно высокий выход очищенного гетеротримера. В своей работе мы предлагаем модификацию вышеописанного метода (рис. 2). Основанием для изменений послужил тот факт, что нам не удавалось осуществить реконструкцию SsoIF2 в клеточном лизате до стадии прогрева. Модифицированная нами методика начинается с того, что клетки суперпродуцентов разрушали и клеточный лизат прогревали индивидуально для каждой субъединицы, а уже затем супернатанты объединяли и фракционировали. Мы также учитывали разный уровень синтеза субъединиц в клетках и по этой причине увеличивали количество биомассы суперпродуцента -субъединицы в три раза. Таким способом мы получали до 40 мг биологически активного SsoIF2 из 5 л общей культуры клеток. Важно, что полученный препарат SsoIF2 с течением времени не подвергался протеолитическому расщеплению в отличие от препарата aIF2, который был выделен в работе Yatime et al., 2007.

разрушение биомассы разрушение биомассы разрушение биомассы разрушение биомассы разрушение биомассы разрушение биомассы А А суперпродуцента суперпродуцента суперпродуцента суперпродуцента суперпродуцента суперпродуцента для -субъединицы для -субъединицы для -субъединицы для -субъединицы для -субъединицы для -субъединицы осаждение дебриса осаждение дебриса осаждение дебриса осаждение дебриса осаждение дебриса осаждение дебриса дебрис дебрис дебрис дебрис дебрис дебрис прогрев клеточного экстракта (65°) прогрев клеточного экстракта (65°) прогрев клеточного экстракта (65°) прогрев клеточного экстракта (65°) прогрев клеточного экстракта (65°) прогрев клеточного экстракта (65°) осаждение денатурированных белков осаждение денатурированных белков осаждение денатурированных белков осаждение денатурированных белков осаждение денатурированных белков осаждение денатурированных белков осадок осадок осадок осадок осадок осадок денатурированных денатурированных денатурированных денатурированных денатурированных денатурированных белков белков белков белков белков белков SsoIFSsoIFБ Б объединение супернатантов объединение супернатантов хроматография на смоле S-сефароза хроматография на смоле S-сефароза хроматография на смоле гепарин-сефароза хроматография на смоле гепарин-сефароза хроматография на смоле супердекс-хроматография на смоле супердекс-Рис. 2. А – Схема выделения и очистки полного гетеротримера SsoIF2 из клеток штаммовпродуцентов E. coli. Б – Электрофоретический анализ (в 15%-ном ДДС-Na-ПААГ) чистоты препарата SsoIF2, полученного на конечной стадии хроматографической очистки.

2. Кристаллизация SsoIF2 и исследования его структуры На тот момент, когда мы приступили к кристаллизации SsoIF2, были известны структуры только изолированных субъединиц фактора инициации трансляции [Cho and Hoffman, 2002; Nonato et al., 2002; Schmitt et al., 2002; Dhaliwal and Hoffman, 2003; Gutierrez et al., 2004; Ito et al., 2004; Roll-Mecak et al., 2004; Yatime et al., 2005]. Позднее появились структуры межсубъединичных димеров и [Sokabe et al., 2006; Yatime et al., 2006], затем структура неполноразмерного гетеротримерного aIF2, в котором первый и второй домены -субъединицы были удалены [Yatime et al., 2007]. В течение четырех лет мы вели интенсивный поиск условий кристаллизации полноразмерного фактора инициации трансляции 2, и нам, в конце концов, удалось получить пригодные к структурным исследованиям кристаллы, на базе которых структура интактного aIF2 была определена [Stolboushkina et al., 2008].

Поиск условий кристаллизации SsoIF2 мы проводили, используя препарат, полученный уже после первой стадии хроматографической очистки, и получили две формы микрокристаллов. Однако этот результат оказался невоспроизводимым.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»