WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 ||

3. Иммуноокрашивание политенных хромосом На политенных хромосомах слюнных желез личинок дрозофилы с помощью иммуноокрашивания специфическими антителами была проведена колокализация субъединицы комплекса TFIID – TAF1 и SAYP. При наложении видно, что сайты локализации TAF1 и SAYP совпадают. Это подтверждает, что in vivo в хроматине SAYP и TFIID находятся в одних и тех же функциональных сайтах (рис. 6). Колокализация SAYP и субъединицы РВАР комплекса - BAPбыла выполнена ранее. Сайты также совпадали. Таким образом SAYP, TFIID и PBAP локализуются на хромосомах в сайтах транскрипции совместно.

Рис 6. Иммуноокрашивание политенных хромосом дрозофилы антителами против TAF1 и SAYP. Показаны два участка хромосом. Показано наложение сайтов локализации TAF1 и SAYP.

4. Распределение компонентов комплекса на промоторе и кодирующей области SAYP-зависимых генов Для исследования функций SAYP и других компонентов общего комплекса in vivo в хроматине также были проведены эксперименты по хроматиниммунопреципитации (ChIP) с последующим анализом количественной ПЦР. В процессе эксперимента была изучена способность компонентов комплекса привлекаться на промоторы SAYP-зависимых генов.

SAYP-зависимые гены (CG11395, CG11400 и globin1) – гены экспрессия которых понижается в 7-10 раз после нокаута SAYP с помощью РНКинтерференции в S2 клетках (данные были любезно предоставлены P. Verrijzer).

Рис 7. Распределение субъединиц комплексов на гене CG1139. Верхняя панель – схема SAYPзависимого гена CG11395 показаны участки гена на промоторной области (ПО) и кодирующей области (КО), использовавшиеся для количественной ПЦР.

Нижняя панель – SAYP, TFIID и PBAP связываются предпочтительнее с промоторной областью гена. Уровень SAYP, субъединиц TFIID (TBP и TAF1) и субъединиц PBAP (BAP170, PB, MOR) комплексов на промоторе (синие столбики) и кодирующей области (серые столбики) гена CG11395 измерялся с помощью ChIP. Все результаты ChIP даны в виде обогащения относительно рДНК.

В результате ChIP с помощью специфических антител к SAYP, субъединицам TFIID (TAF1 и TBP) и субъединицам PBAP (BAP170, PB и MOR) выявил, что все компоненты общего комплекса стабильно связываются с промоторной областью гена (ПР) и в значительно меньшей степени с кодирующей областью (КО) (рис. 7).

5. Влияние «нокдаунов» компонентов комплекса на связывание общего комплекса с промоторами SAYP-зависимых генов:

5.1. Влияние нокдауна SAYP на распределение компонентов TFIID и PBAP на промоторах SAYP-зависимых генов С помощью РНК-интерференции был проведен отдельно «нокдаун» каждого из компонентов общего суперкомплекса в S2 клетках и также методом ChIP с последующим анализом количественной ПЦР изучена способность SAYP и комплексов TFIID и PBAP привлекаться на промоторы CG11395, CG11400 и globin1 генов.

В результате «нокдауна» SAYP происходит значительное падение уровня компонентов комплексов TFIID (TAF1 и ТВР) и PBAP (BAP170, PB и MOR) на промоторах всех трех генов (рис. 8). «Нокдаун» SAYP не влияет на общий уровень TBP и TAF’s в S2 клетках – количество субъединиц комплекса остается прежним, что видно из результатов Вестерн-блот анализа (рис. 9,а). Однако в результате «нокдауна» SAYP уменьшался общий уровень субъединиц PB и BAP170 комплекса РВАР в клетках (рис. 9,а), что, несомненно, влияло на привлечение РВАР к промоторным областям в хроматине. Таким образом, можно утверждать, что TFIID комплекс не может связываться с промоторными участками SAYP-зависимых генов в отсутствие SAYP и комплекса PBAP.

Рис 8. SAYP, PBAP, TFIID совместно привлекаются на промоторы и каждый из них является ключевым в этом процессе. Уровень SAYP, TFIID и PBAP комплексов на промоторе CGбыл изучен на нормальных S2 клетках (синие столбики), и после «нокдауна» SAYP (зеленые столбики), «нокдауна» BAP170 (красные столбики), «нокдауна» TAF4 (желтые столбики), аналогичные эксперименты провели для изучения уровня РНК-полимеразыII (PolII).

В качестве отрицательного контроля рассматривали связывание компонентов комплекса с промотором гена Hsp70, который не является SAYP-зависимым геном, и SAYP в нормальных S2 клетках не обнаруживается на его промоторах, что и было подтверждено с помощью СhIP (рис. 10). «Нокдаун» SAYP не влиял на уровень TFIID на промоторе Hsp70. Уровень компонентов PBAP немного падает, так как падает общее содержание РВАР в клетке (рис. 9) после интерференции SAYP (рис. 10).

Рис 10. Уровень TFIID комплекса наSAYP-независимом гене Hsp70 не изменялся после «нокдауна» SAYP.

Уровень SAYP, субъединиц TFIID (TAF1 и TBP) и cубъединиц PBAP (PB и BAP60) в нормальных S2 клетках (нсиние столбики) и после «нокдауна» SAYP (SAYPи – голубые столбики).

5.2. Влияние «нокдауна» ВАP170 на распределение SAYP и компонентов комплексов TFIID и PBAP на промоторах SAYP-зависимых генов.

При «нокдауне» субъединицы BAP170 комплекса PBAP происходит значительное падение уровня SAYP и субъединиц комплекса TFIID на промоторах SAYP-зависимых генов (рис. 8). В то же время общий уровень субъединиц комплексов PBAP и TFIID в S2 клетках уменьшался, но общий уровень SAYP оставался прежним (рис. 9,а). Из этого можно сделать вывод, что свободный SAYP не привлекается на промоторы в отсутствие комплексов PBAP и TFIID.

Рис 9. а – общий уровень SAYP и субъединиц комплексов PBAP (PB, BAP170, MOR) и TFIID (TAF1, TAF4, TBP) в нормальных S2 клетках (S2кл-норм) и после «нокдауна» - РНКинтерференции (РНКи) SAYP, BAP170, TAF4 соответствующими двуцепочечными РНК, выравнивание проводили по тубулину; б – в отсутствии TFIID SAYP соосаждается комплексом PBAP. Иммунопреципитации антителами к SAYP были выполнены на нормальных S2 клетках после «нокдауна» TAF4. 25% исходной фракции (ИФ) и 50% преципитата (ИП) нанесено.

5.3. Влияние «нокдауна» TAF4 на распределение SAYP и компонентов TFIID и PBAP на промоторах SAYP-зависимых генов РНК-интерференция TAF4 также оказывала сильный отрицательный эффект на связывание РВАР и SAYP с промоторами SAYP-зависимых генов (рис. 8). Согласно сведениям, опубликованным ранее, «нокдаун» TAFприводил к разрушению комплекса TFIID (Wright et al., 2006), не влияя на общий уровень SAYP и PBAP (рис.9,а). При этом SAYP оставался в клетке в связанном с PBAP состоянии (рис. 9,б), однако этот комплекс (PBAP & SAYP) без TFIID не способен стабильно ассоциировать с промоторами SAYPзависимых генов (рис.8). Этот результат наиболее важен, так как согласно модели последовательного привлечения транскрипционных факторов на промотор, ремоделирующий комплекс должен первым ассоциировать с промотором независимо от других.

«Нокдауны» белков SAYP, BAP170 или TAF4 также значительно понижали уровень РНК- полимеразы II на промоторах изучаемых SAYPзависимых генов (рис. 8), подтверждая, что присутствие SAYP, TFIID и PBAP на промоторах является необходимым условием при активации транскрипции.

III. ОБСУЖДЕНИЕ Активация транскрипции – сложный процесс, требующий участия и координированной работы многих комплексов. В нашей работе было показано, что координация ремоделирования хроматина и инициации транскрипции, двух ключевых процессов активации транскрипции, может осуществляться единым суперкомплексом, состоящим из коактиватора транскрипции SAYP, общего фактора транскрипции TFIID и ремоделирующего хроматин комплекса PBAP. В один общий комплекс с SAYP связываются только 20% TFIID и несколько процентов PBAP в экстракте клетки. При этом транскрипция, опосредованная SAYP, широко распространена в геноме дрозофилы: при колокализации SAYP и РНК-полимеразы II на политенных хромосомах в эухроматине было обнаружено около 150 сайтов, что в настоящей работе было подтверждено колокализацией SAYP и TAF1.

Несмотря на то, что ранее встречались сведения, что SAYP ассоциирован с комплексом PBAP, с помощью СhIP нами было показано, что в таком состоянии этот комплекс не способен связываться с промоторами SAYPзависимых генов и является нефункциональным. Также с помощью ChIP была показана необходимость присутствия на промоторах SAYP-зависимых генов каждого из компонентов единого суперкомплекса. Привлечение SAYP, PBAP или TFIID в свободном состоянии на эти промоторы невозможно. Таким образом, общий суперкомплекс функционирует при активации транскрипции как единый модуль, а взаимодействия между его субъединицами и с окружающими белками необходимы для стабильного взаимодействия суперкомплекса с промоторами SAYP-зависимых генов.

Ключевая роль в организации общего комплекса принадлежит коактиватору SAYP, с которым могут взаимодействовать активаторы, таким образом, обеспечивая специфичность активации транскрипции соответствующих генов, как предполагалось ранее.

Ремоделинг хроматиновой матрицы – ключевой этап активации транскрипции, а связывание TFIID комплекса лимитирует скорость инициации транскрипции, поэтому объединение нескольких активностей компонентов в одном суперкомплексе может быть оправдана и функционально реализоваться, т.к. не требует предварительно подготовленной матрицы для инициации траскрипции. Активация SAYP-зависимых генов не зависит от локального состояния хроматина и от общего состояния транскрипционного аппарата, что может быть необходимым в процессе развития организма. В случае единого суперкомплекса сопряжение TFIID и PBAP может повышать эффективность транскрипции определенных генов. Таким образом, общий суперкомплекс способен осуществлять активацию транскрипции определенных генов независимо от положения гена в хроматине, локальной концентрации TFIID или афинности компонентов к промотору.

IV. ВЫВОДЫ 1. Выделен и охарактеризован новый комплекс, состоящий из общего фактора транскрипции TFIID, ремоделирующего хроматин комплекса PBAP и коактиватора транскрипции SAYP. Показано, что в состав нового комплекса входят все субъединицы комплексов TFIID и PBAP.

2. SAYP – основной фактор клетки, объединяющий TFIID - общий фактор транскрипции и PBAP - комплекс, ремоделирующий хроматин.

3. Единый комплекс, содержащий PBAP, TFIID и SAYP, локализуется на промоторах SAYP-зависимых генов и необходим для рекрутирования РНКполимеразы II.

4. Все компоненты общего комплекса (SAYP, TFIID, PBAP) необходимы для его эффективного связывания с промоторами SAYP-зависимых генов V. СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ 1. Сошникова Н.В., Воробьева Н.Е., Краснов А.Н., Георгиева С.Г., Набирочкина Е.Н., Ильин Ю.В, Шидловский Ю.В. Взаимодействие коактиваторов на промоторе. ДАН, 2008, 423: 561-563.

2. Soshnikova N.V., Vorobyeva N.E., Georgieva S.G., Shidlovskii Y.V., Ilyin Y.V.

Novel transcription factor SAYP directly couples chromatin remodeling and transcription initiation. Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to 120th anniversary of M.I. Vavilov, Ukraine, Kyiv, 20-22 September 2007,

Abstract

book, p. 3. Soshnikova N., Georgieva S. The ubiquitous transcription co-activator SAYP interacts with PBAP chromatin remodeling complex and recruits PBAP on gene promoters. Spring-Meeting and Workshop “Protein-protein interactions” of the International Research Training Group Gieen/Marburg-Moscow (DFG/RFBRfunded) from 9th - 12th of March 2008 in Schlo Rauischholzhausen, Germany.

Abstract book. p. 31.

4. Soshnikova N., Vorobyeva N., Shidlovskii Y., Georgieva S., Ilyin Y. Novel mechanism of coupling of chromatin remodeling and transcription initiation.

33rd FEBS Congress & 11th IUBMB Conference, Biochemistry of cell regulation, Athens, Greece, 28th of June- 3rd of July 2008, Abstract book, p. 156.

5. Soshnikova N., Vorobyeva N., Shidlovskii Y., Georgieva S., Ilyin Y. Novel mechanism of coupling of chromatin remodeling and transcription initiation. 8th Young Scientist Forum FEBS-IUBMB: Cell Harmony, Loutraki, Greece, 26th 28th of June, Abstract book p. 134.

Pages:     | 1 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»