WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

При этом утрачивается повышенная электронная плотность этого структурного образования. Такая ультраструктура митохондрий была описана Ревелом и соавт.

для крикотироидной мышцы летучей мыши (схема В). Особенностью этих структурных образований является обратимость перестроек внутренней митохондриальной мембраны. Как показали наши исследования, при выделении митохондрий по общепринятой методике в 0,25 М Фот. 3 а, б. Ультраструктура локальных сахарозе эти структурные перестройки перестроек внутренней мембраны внутренней митохондриальной мембраны митохондрий при добавлении в срезу инкубации 0,1мМ АДФ. В-схема исчезают. Нам никогда не удавалось ультраструктуры митохондрии по Revel обнаружить эти структуры в изолированных J.P. et al., 1963.

митохонриях. Гипоксия является сильным стрессовым воздействием на клетку. Можно предположить, что наблюдаемые нами ультраструктурные изменения внутренней мембраны митохондрий кардиомиоцитов также могут быть компенсаторной реакцией, обеспечивающей более высокую жизнеспособность митохондрий клетки в экстремальных условиях гипоксии.

2.Исследование функциональной активности митохондрий кусочков изолированной ткани миокарда, инкубированных в условиях длительной гипоксии.

Обнаруженные нами в условиях экспериментально вызванной кислородной недостаточности изолированной ткани миокарда особенности ультраструктуры митохондрий неотделимы от функциональных процессов в ткани миокарда, лишённой кислорода. Мы провели исследование функциональных особенностей митохондрий нашей экспериментальной ткани на суспензии изолированных митохондрий, а так же непосредственно in situ методом электронномикроскопической гистохимии.

2.1 Особенности системы окислительного фосфорилирования митохондрий, выделенных из ткани миокарда, инкубированной в условиях длительной гипоксии.

Для исследования функциональных характеристик митохондрий нашей экспериментальной ткани было проведено выделение из кусочков ткани миокарда, инкубированных в условиях гипоксии фракций митохондрий, осаждённых на различных скоростях дифференциального центрифугирования.

Был проведён ультраструктурный анализ полученных фракций. “Тяжёлая“ (1700g) фракция наряду с миофибриллами, ядрами кардиомиоцитов содержала кластеры митохондрий, объединённые межмитохондриальными контактами.

Внутри отдельных митохондрий обнаруживались мелкие электронно-плотные митохондрии. Митохондрии ”средней” фракции (10000g) имели ультраструктуру, характерную для митохондрий, изолированных в 0,25М сахарозе: округлую форму, увеличенное межмембранное пространство, сжатый матрикс. При электронномикроскопическом исследовании ”лёгкой” фракции (17000g) было выявлено, что эта фракция содержит мелкие электронно-плотные митохондрии, по своей ультраструктуре соответствующие электронно-плотным митохондриям, расположенным внутри более крупных электронно-светлых митохондрий. Эти электронно-плотные митохондрии ”лёгкой” фракции имели наружную и внутреннюю мембраны, а их средний диаметр составлял 0,15 мкм. Так же в этой фракции обнаруживались мелкие набухшие митохондрии, набухание которых, очевидно, происходило из-за нарушения мембран во время процесса выделения.

Нами были проведены сравнительные исследования дыхательных характеристик митохондрий, выделенных на скорости 10000g из контрольной интактной ткани миокарда и из экспериментальной ткани - ”средней” фракции митохондрий. Так же параллельно с измерением скоростей дыхания измерялся мембранный потенциал () экспериментальных и контрольных митохондрий.

Дыхательные характеристики контрольных митохондрий приведены на рис. 1. Скорости дыхания на субстратах первого (глутамат и малат) и второго (сукцинат) комплексов дыхательной цепи, а так же Рис. 1. Дыхание (верхняя кривая) и мембранный увеличение скорости дыхания потенциал () (нижняя кривая) митохондрий, при добавлении АДФ и FCCP выделенных из интактной ткани миокарда. Добавки:

Mit- митохондрии, 0.5 мг белка, ADP –АДФ, rot – соответствовали описанным в ротенон 1 мкМ, suc – сукцинат 10мМ, FCCP – FCCP 0.литературе данным для мкМ, (глутамат и малат содержался в среде инкубации).

изолированных митохондрий контрольной ткани миокарда. Исследование функции дыхательной системы митохондрий ”средней” фракции, выделенных из экспериментальной ткани сердца показало, что максимальная скорость дыхания митохондрий на субстратах первого (глутамат и малат) и второго (сукцинат) комплексов дыхательной цепи в течение 24 часов инкубации не снижается относительно скорости дыхания контрольных митохондрий (рис. 2, таблица 1).

Таблица 1. Максимальные скорости дыхания митохондрий.

Препарат митохондрий Субстраты Скорость дыхания N дыхания (нг ат О/ мг белка) глут. +мал.

Контрольные митохондрии * 124 22 сук.+рот.

127 25 глут. +мал.

Митохондрии, выделенные 120 26 из ткани микарда, сук.+рот.

128 25 инкубированной 24 часа в гипоксии** глут. +мал.

Митохондрии, выделенные 5 5 из ткани микарда, сук.+рот.

120 30 инкубированной 72 часа в гипоксии** - среднеквадратичное отклонение, N – количество экспериментов, * - дыхание в состоянии 3 по Чансу, ** - дыхание не стимулируется разобщителем АДФ.

При этом фосфорилирующая функция митохондрий экспериментальной ткани полностью нарушена: добавление АДФ не стимулирует скорость дыхания, мембранный потенциал () после добавления субстратов дыхания незначительно возрастает, но затем быстро спонтанно падает (рис. 2).

Рис. 2. Дыхание (верхняя мембранный потенциал Сукцинатоксидазная активность (нижняя кривая) митохондрий, выделенных из ткани миокарда, инкубированной кривая) и в остаётся без изменений даже условиях гипоксии в течение 24 часов. Добавки:

через 72 часа инкубации см. рисунок 1.

экспериментальной ткани в условиях гипоксии. Это показано на рис. 3, где видно, что скорость дыхания митохондрий на субстрате второго комплекса (сукцинат) не падает по сравнению со скоростью дыхания контрольных митохондрий. Но уже через 72 часа инкубации ткани миокарда в гипоксии полностью подавляется малатоксидазная активность митохондрий, т.е. после добавления субстратов первого комплекса (глутамат и малат) стимуляции дыхания не происходит (рисунок 3. таблица 1). Добавление АДФ не стимулирует скорости дыхания, мембранный потенциал () не возрастает.

Результаты проведённых исследований показывают, что система окислительного фосфорилирования митохондрий экспериментальной ткани быстро разобщается в процессе инкубации ткани в условиях гипоксии: стимуляция скорости дыхания при добавлении АДФ не происходит. При этом Рис. 3. Дыхание (верхняя кривая) и мембранный функция дыхательной цепи потенциал (нижняя кривая) митохондрий, сохраняется длительное время:

выделенных из ткани миокарда, инкубированной в условиях гипоксии в течение 72 часов. Добавки см. малатоксидазная активность рисунок 6, KCN - 1мМ KCN.

регистрируется в течение часов инкубации, а сукцинатоксидазная активность регистрируется в течение часов инкубации.

2.2 Выявление цитохром с оксидазной активности митохондрий изолированных кусочков миокарда, инкубированных 72 часа в условиях гипоксии.

Исследования на митохондриях, изолированных из экспериментальной ткани, не позволяют получить полную функциональную характеристику всех морфологических типов гетерогенной популяции митохондрий. Кроме того, приведённые выше функциональные характеристики митохондрий экспериментальной ткани отражают особенности функционирования суспензии изолированных митохондрий, в то время как огромный интерес представляет получение функциональных характеристик митохондрий кардиомиоцитов исследуемой экспериментальной ткани непосредственно in situ, без разрушения ткани.Мы провели исследование на цитохром с оксидазную (ЦО) активность митохондрий кардиомиоцитов после 3 суток инкубации ткани в условиях гипоксии широко известным в литературе с 1968 г методом электронно-микроскопической гистохимии (Seligman et al., 1968; Novikoff and Goldfischer, 1969; Nonaka et al., 1989; Angermuller et al., 1998; Walker and Benzer, 2004). Метод основан на способности цитохрома с окислять 3,3`-диаминобензидин (ДАБ). ДАБ проникает в межмембранное пространство митохондрий, но не идет в матрикс. В комплексе IV (ЦО) дыхательной цепи митохондрий в первом шаге цитохромоксидазной реакции митохондрий происходит окисление ДАБ цитохромом с, что приводит к полимеризации ДАБ-а. Полимеры вступают в реакцию с оксидом осмия, образуя осмиофильный осадок. Продукт данной реакции, в отличие от методов, основанных на Nadi реакции имеет не капельную форму, а проявляется в виде мелкодисперсного осадка, который более точно выявляет цитохром с оксидазу в митохондриях, заполняя внутрикристное пространство и пространство между ограни-чивающими митохондрию наружной и внутренней мембранами, благодаря чему места активной работы цитохром с оксидазы четко видны на электронномикроскопических препаратах. На фот. 4 а электронно-микроскопическая картина митохондрии кардиомиоцита контрольной ткани на большом увеличении, полученная в результате проведения реакции на цитохром с оксидазную активность. Видно, что внутрикристное пространство митохондрии контрольной ткани заполнено электронно-плотным осадком. Так же электронно-плотный осадок присутствует между наружной и внутренней, ограничивающих митохондрию мембранами и во внутрикристном пространстве. После длительного действия гипоксии картина реакции резко меняется. На фот. 4 б четко видно, что внутри электронно-плотной митохондрии по всей длине мембран крист присутствует мелкодисперсный осадок, в то время как в основной митохондрии реакция на цитохром с оксидазу отсутствует (ЦО-). Сравнение картины реакции митохондрий контрольной ткани (фот. 4 а) и картины реакции митохондрий экспериментальной ткани, содержащей мелкую, электронноплотную митохондрию (фот. 4 б), показывает локальную сохранность цитохром с - оксидазной активности только лишь в мелкой электронно-плотной митохондрии, при полном отсутствии цитохром с - оксидазной активности в основной митохондрии.

Характерной, удивительной особенностью наших экспериментальных условий является наличие в кардиомиоцитах значительного количества межмитохондриальных контактов нативной структуры. При исследовании цитохром с- оксидазной активности в наших экспериментальных условиях оказалось, что в области Фот. 4 а, б. Электронно-микроскопическая картина межмитохондриальных контактов митохондрий после реакции на цитохром с- оксидазную активность: а - митохондрия видна ярко выраженная ЦО+ кардиомиоцита контрольной ткани миокарда, б- реакция. В контрольной ткани в митохондрия экспериментальной ткани.

отличие от экспериментальной межмитохондриальные контакты нам наблюдать не удалось. По нашему мнению, это можно объяснить тем, что согласно использованной методике ткань инкубируется в течение 3 ч при температуре 37оС.

В таких условиях межмитохондриальные контакты нативной ткани разрушаются (Тихова и др., 1988). Тем удивительнее являются результаты наших наблюдений многочисленных межмитохондриальных контактов в экспериментальной ткани, которая также инкубировалась 3 ч при температуре 37оС.

3 Динамика изменений ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов изолированного миокарда крысы при длительной инкубации в условиях гипоксии.

Чтобы выяснить, не является ли обнаруженное нами явление образования «митохондрий внутри митохондрий» артефактом условий эксперимента, а также для выяснения ультраструктурного механизма возникновения необычной митохондриальной популяции мы провели исследование состояния ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов изолированных кусочков миокарда, инкубируемых 72 ч в условиях гипоксии, через 6, и далее через каждые 12 ч.

Через 6 ч инкубации кусочков изолированного миокарда в условиях гипоксии популяция митохондрий кардиомиоцитов одинакова по своей ультраструктуре - это Фот. 5 а, б. Начальные стадии формирования митохондрии органеллы со сжатым, внутри митохондрии. а - появление электронно-прозрачной полости внутри митохондрии, б- перемещение участка электронно-плотным маматрикса, ограниченного внутренней митохондриальной триксом, параллельно мебраной, в межмембранное пространство.

ориентированными кристами. Характерным ультраструктурным признаком митохондриальной популяции кардиомиоцитов на данное время инкубации являются необычные структурные образования внутри митохондрий.

Первоначально в межмембранном пространстве митохондрий возникают незначительные по размеру (расположенные в пределах 1,5 – 2 серийных срезов) электронно-прозрачные замкнутые полости, диаметр которых составляет порядка 0.15 мкм (фот. 5 а, стрелка на рис. а). Далее в эту полость перемещается участок матрикса, ограниченный внутренней мтохондриальной мембраной (фот.5, б).

Митохондрия на фот. 5, б, имеет обводненный матрикс, что позволяет детально анализировать организацию этой структуры внутри митохондрии. Стрелкой показано перемещение петлеобразной складки внутренней мембраны с примыкающим к ней матриксом в полость, образованную внутренней митохондриальной мембраной. Далее происходит отшнуровывание этого участка матрикса, ограниченного внутренней митохондриальной мембраной. Нужно Фот. 6 а, б. Образование «митохондрии внутри митохондрии» на заметить, что на ч винкубации ткани в условиях гипоксии: при малом (а) и большом этой стадии вокруг (б) увеличении.

полости образуется электронно-плотный слой (фот. 5 а, показано стрелкой). Через 12 ч инкубации ткани миокарда при гипоксии наблюдается увеличение этих структур внутри митохондрий и формирование их мембранного содержимого (фот. 6, а, б). На большом увеличении видно, что эта структура уже имеет ограничивающие мембраны (фот. 6 а, б). Также видно, что вновь образованная структура не связана с основной митохондрией, кристы митохондрии основной популяции как бы «обрываются», образуя замкнутую полость, окружающую вновь образующуюся структуру. Электронно-плотный слой вокруг этой структуры сохраняется. На данный срок инкубации во все большем количестве митохондрий происходит формирование этих структурных новообразований и в пределах одного среза можно видеть различные стадии этого процесса. То есть процесс формирования новых структур внутри митохондрий происходит не одномоментно во всех митохондриях, а постепенно затрагивает все новые органеллы.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»