WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

b b t=t=Экспериментальные данные были объяснены с помощью модели фотодинамических реакций с участием флорицина и синглетного кислорода. Окисление флорицина на поверхности БЛМ приводит к образованию продукта, молекула которого имеет отличающиеся от флорицина дипольный момент и константу диссоциации. Продукт выходит из мембраны в раствор, а убыль флорицина на БЛМ компенсируется его адсорбцией из раствора. Модель позволила получить выражения для начальной скорости R и предельной (при бесконечной скорости окисления) амплитуды Vlim фотоэффекта:

pH - pK A kd P(1 + 10 ) P(1+10pH - pKA), R = -kp[1O2]1- Vlim = 1 pH - pKP A(1+10pH - pKP ) k (1 + 10 ), pd A где kp –скорость реакции, 1O2 концентрация синглетного кислорода, A и P нормальные составляющие дипольного момента флорицина и продукта, KA и KP – константы их диссоциации, H - концентрация ионов водорода. Из этих формул видно, что величина фотоэффекта и его зависимость от рН находятся в соответствии с дипольными моментами флорицина и продукта, а также их констант диссоциации.

Оценка проницаемости БЛМ для синглетного кислорода, P1O, в соответствии с (Sokolov,V.S. and Pohl,P 2008) проводилась по формуле:

1 J = P1O([O2] -[O2] ), 2 где [1O2]1 и [1O2 ]2 – концентрации синглетного кислорода по одну и другую стороны мембраны. J -поток 1O2 сквозь мембрану.

В эксперименте определялось отношение скоростей окисления флорицина с двух сторон БЛМ, которое пропорционально отношению концентраций синглетного кислорода на границах:

[1O2]2 Rcis =.

[1O2]1 Rrans Исключить [1O2]1 и [1O2]2 удалось, рассмотрев уравнение диффузии D и тушения kq синглетного кислорода в воде около БЛМ. Пусть концентрация синглетного кислородаx в растворе [1O2](x) является функцией координаты х –расстояния от границы мембраны. Тогда уравнение выглядит следующим образом, d [1O2 ](x) 0 = -kq[1O2 ](x)+ D dxУравнение дополняется граничными условиями – закон Фика у поверхности БЛМ и нулевая концентрация [1O2 ] на бесконечном расстоянии от БЛМ:

d[1O2 ](x) J = - D и [1O2](x) = 0.

x = dx x=Из решения уравнения следует, что J [ O2] =.

Dkq Эти уравнения позволили получить простое выражение для оценки проницаемости БЛМ для синглетного кислорода Dkq P1O =.

Rcis -Rtrans Из наших экспериментов было получено, что Rcis/Rtrans 3. Если использовать для оценки известные значения kq 3 x 105 с-1 (Rodgers, M.A.J, 1982; Krasnovsky, A.A., 1998) и D 4.75 x 10-5 cм2 с-1 (Fischkoff, S., 1975), то P1O 2 cм/с.

Полученное значение проницаемости оказалось значительно ниже проницаемости БЛМ для обычного кислорода, которая, согласно данным, полученным методом ЭПР, составляет около 210 - 230 см/с (Subczynski, W. K., 1989; Dzikovski, B. G., 2003). Возможно это различие связано с тем, что синглетный кислород не только проникает через мембрану, но и подвергается тушению. Однако, как показали наши дальнейшие исследования, полученная оценка оказалась заниженной, поскольку не учитывает, что как флорицин, так и продукт его окисления способны к латеральному обмену с окружающим мембрану тором.

Об участии латерального обмена свидетельствует обнаруженная нами зависимость фотоэффекта от размеров мембраны. Мы показали, что если сформировать мембрану методом Монталла на отверстии с диаметром около 0,1 мм, транс-фотоэффект пропадает, а цисфотоэффект остается (рис.11).

0,0,0,Цис Транс Цис Транс Рис.11 Сопоставления величин цис- (1,3) и транс-эффектов(2,4) в экспериментах на мембранах, сформированных методом Монталла (1,2) и мембранах, сформированных методом Мюллера-Рудина (3,4).

Главное отличие Монталловских мембран от мембран, сформированных методом Мюллера-Рудина в том, что в них отсутствует растворитель - декан. Чтобы проверить, влияет ли на фотоэффекты наличие растворителя, были сформированы «сухие» мембраны методом Мюллера-Рудина, которые не содержали декан. Для этого использовался раствор липидов в гексадекане, который не попадает в бислой, а концентрируется в области тора. Оказалось, что транс-фотоэффекты в таких мембранах также наблюдаются. Таким образом, исчезновение транс-фотоэффектов можно объяснить лишь малыми размерами Монталловских мембран (0,мм) по сравнению с Мюллеровскими (0,7-2,5 мм). Влияние размеров мембран на величину фотоэффекта было изучено в экспериментах на мембранах, сформированных методом Мюллера на отверстиях разного диаметра. Результаты представлены на рисунке 12. Видно, что величина транс-фотоэффекта практически линейно зависит от емкости мембраны, по величине которой можно судить о площади.

-Начальный наклон, мин Впервые возможность латерального обмена между бислоем и тором была продемонстрирована в работе (Benz, 1973), где было показано, что удельная проводимость мембран при встраивании в них валиномицина из водного раствора зависела от площади. При больших отверстиях (более 3 мм) эта зависимость выходила на насыщение, и только в этих условиях (насыщения) величина проводимости определялась равновесным распределением валиномицина между мембраной и водой, при котором латеральным обменом можно было пренебречь. В случае же экспериментов на отверстиях, не превышающих 1,5 мм, которые использовались в наших экспериментах, латеральный обмен существенен.

0,0,0,0,0,0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,C, нФ Рис.12. Зависимость величины фотоэффекта от емкости мембраны, то есть, по сути, от «рабочего» размера отверстия.

В работе Benz, 1973, была выдвинута гипотеза, что латеральный обмен происходит вследствие непрерывного обновления липидного бислоя на границе с тором, в котором участвуют фосфолипиды. В наших экспериментах оказалось возможным это проверить, если использовать в качестве мишени синглетного кислорода ненасыщенные липиды. Для этого были сформированы несимметричные мембраны, один из монослоев которых состоял из DPhPC, а другой из DOPC. Известно, что в окислении может участвовать только липиды, содержащие ненасыщенные связи, поэтому окисление могло происходить только в монослое, содержащем ненасыщенный липид DOPC, и не происходило в другом монослое, сформированном из насыщенного липида DPhPC.

-Начальный наклон, мин 100 мкМ AlPcSсвет 0 свет --0 20 40 60 80 t, мин Рис. 13. Окисление ненасыщенных липидов. (1) Цис-сторона мембраны: DOPC(66%) и DOPE(33%), транс-сторона: DPhPC, (2) Цис-сторона мембраны: DPhPC, транс-сторона:

DOPC(66%) и DOPE(33%). Водный раствор: 100 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7.Сначала добавляли фталоцианин со стороны монослоя DOPC (рис.13, кривая 1) мембраны и наблюдали его адсорбцию по изменению граничного потенциала. Затем освещали систему и наблюдали монотонное изменение потенциала, знак которого соответствовал положительному заряжению мембраны со стороны того монослоя, где находились ненасыщенные липиды. Рост потенциала можно объяснить тем, что при освещении появляются сшивки двойных связей липидов по свободнорадикальному механизму под действием синглетного кислорода, генеририруемого возбужденной молекулой фталоцианина.

Так же, как и с флорицином, проводили два типа экспериментов: в одном фталоцианин находился со стороны монослоя DOPC, в другом со стороны насыщенного DPhPC. Оказалось, что фотоэффект наблюдался только в первом случае (кривая 1 на рисунке 13) и практически отсутствовал во втором (кривая 2). Таким образом, как в экспериментах с флорицином, так и с ненасыщенными липидами, «транс»-фотоэффект отсутствовал. Эти результаты означают, что с обеими мишенями причина отсутствия транс-фотоэффекта может быть одна и та же, а именно, продукты окисления мишени не удается обнаружить из-за того, что они исчезают вследствие латерального обмена между липидным бислоем и тором.

Синглетный кислород может проникать только через бислой, но не через тор, толщина которого (порядка миллиметра) превышает длину его свободного пробега. Поэтому в условиях наблюдения транс-фотоэффекта фотодинамические реакции происходят только на b, мВ поверхности бислоя, но не тора, где есть адсорбированные молекулы мишени. В этом случае из-за латерального обмена между бислоем и тором происходит отток продуктов окисления в тор и замена их на нативные молекулы мишени. Поскольку латеральный обмен происходит на границе между бислоем и тором, его эффективность зависит от размеров мембраны. В случае, если мембрана имеет очень маленький диаметр, латеральный обмен настолько эффективен, что не позволяет наблюдать фотоэффект, поскольку скорость образования продуктов окисления в бислое оказывается значительно ниже скорости их замены на нативные молекулы из тора.

В случае цис-фотоэффекта фотодинамические реакции окисления могут происходить на поверхности как бислоя, так и тора, поскольку он проницаем для света, а на его поверхности, как и на поверхности мембраны, находятся молекулы фотосенсибилизатора и мишени. В этом случае латеральный обмен ни к чему не приводит, так как поверхность тора содержит те же продукты окисления мишени, что и бислой. Тогда и усиление латерального обмена на мембранах малого размера не приводит к ослаблению фотоэффекта. Именно поэтому диаметр мембраны влияет только на транс-фотоэффекты, но не на цис-фотоэффекты.

Из данных экспериментов следует, что заниженная оценка проницаемости мембраны для синглетного кислорода связана с тем, что наша мембрана имела недостаточно большой диаметр, поэтому транс-фотоэффект занижался из-за латерального обмена продуктов окисления между бислоем и тором. Зависимость величины фотоэффекта от размеров мембраны не обнаружила насыщения, поэтому оценить проницаемость мембраны для синглетного кислорода в условиях, когда латеральным обменом можно пренебречь, не удалось.

Таким образом, в результате проведенного исследования удается получить только нижнюю оценку этой проницаемости, то есть ее величина больше, чем 2 cм/с. Более точную оценку данным способом можно получить только если удастся найти мишень с большей чувствительностью для синглетного кислорода, для которой эффектом латерального обмена можно будет пренебречь в экспериментах с реальными размерами мембраны.

ВЫВОДЫ 1) Изучено встраивание побочного продукта цикла зрительного родопсина А2Е в мембрану. Показано, что изменение граничного потенциала при встраивании А2Е в мембрану происходит в диффузном слое около мембраны, что говорит о том, что заряженная группа A2E расположена вблизи границы раздела мембраны с раствором.

2) Показано, что граничный потенциал изменяется при освещении А2Е на поверхности мембраны в результате окисления А2Е кислородом с образованием нескольких продуктов. Один из продуктов является гидрофильным и десорбируется с поверхности мембраны. По этой причине мембранная фототоксичность А2Е оказывается существенно более слабой, чем у известных фотосенсибилизаторов.

3) Изучена адсорбция на БЛМ различных аналогов фталоцианинов, различающихся числом сульфогрупп и атомом металла в центре молекулы. Показано, что адсорбция тетрасульфированных фталоцианинов происходит благодаря координационной связи атома металла с фосфатной группой фосфолипидов. Эффективность адсорбции разных аналогов фталоцианина коррелирует с их эффективностью как фотосенсибилизаторов.

4) Показано, что граничный потенциал, возникающий при адсорбции фталоцианинов, зависит от числа сульфогрупп в молекуле. В случае тетрасульфированного фталоцианина потенциал возникает в диффузном электрическом слое и может быть описан теорией Гуи-Чепмена. По мере уменьшения числа сульфогрупп в молекуле фталоцианина возрастает вклад дипольной составляющей граничного потенциала. В случае моносульфированного фталоцианина граничный потенциал оказывается чисто дипольным.

5) Изучено окисление флорицина синглетным кислородом, образующимся при фотовозбуждении фталоцианинов на поверхности мембраны с помощью регистрации изменений граничного потенциала при освещении. Окисление происходило не только в том случае, когда фотосенсибилизатор и мишень были расположены на одной границе мембраны (цис-фотоэффект), но и в том случае, когда они находились на противоположных границах мембраны (транс-фотоэффект), благодаря транспорту синглетного кислорода через мембрану.

Показано, что транс-фотоэффект зависит от размеров БЛМ, из-за латерального обмена флорицина и продуктов его окисления между липидной мембраной и окружающим ее тором.

6) Обнаружено изменение граничного потенциала при фотоокислении липидов в несимметричных БЛМ, один из монослоев которых содержит насыщенные, а другой ненасыщенные липиды. Показано, что данный фотоэффект имеет место только в случае, если фотосенсибилизатор адсорбирован со стороны монослоя, содержащего ненасыщенные липиды.

7) Сделана оценка проницаемости мембраны для синглетного кислорода, основанная на сравнении скоростей окисления флорицина с двух сторон мембраны, величина проницаемости оказалась не менее 2 cм/с. Эта оценка представляет собой только нижний предел, поскольку на величину фотоэффекта оказывает влияние латеральный обмен продуктов окисления мишени синглетным кислородом между липидным бислоем и тором.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Соколенко, Е. А., Соколов, А. B., Финогенова, О. А., Соколов, В. С., Донцов, А. Е.

Влияние продуктов фотолиза зрительного родопсина на бислойные липидные мембраны. 2, 458-459. 2004. Воронеж. 111 Cъезд биофизиков России. 24-6-2004.

2. Sokolenko, E. A., Sokolov, V. S., Sokolov, A. V., Finogenova, O. A., Dontsov, A. E., Ostrovsky, M. A. Interaction of pyridinium bis-retinoid (A2E) with bilayer lipid membranes.

Eur.Biophys.J. 34[6], 772. 2005.

3. Sokolenko, E. A., Sokolov, V. S., Sokolov, A. V., Finogenova, O. A., Dontsov, A. E., Ostrovsky, M. A. Interaction of bis-retinoid (A2E) with bilayer lipid membranes. 236. 2005. 8th International Frumkin Symposium "Kinetics of electrode processes", Moscow, 18 Oct - 22 Oct 2005.

18-10-2005.

4. Sokolov, V. S., Ayuan, A. G., Lenz, A. A., Sokolenko, E. A., Wiesner, B., Pohl, P.

Membrane diffusion of singlet oxygen: bare lipid bilayers versus membranes reconstituded with aquaporin-1. Eur.Biophys.J. 34[6], 653. 2005.

5. Соколов,В.С., Е.А.Соколенко, А.B.Соколов, О.А.Финогенова, А.Е.Донцов, and М.А.Островский. 2005. Взаимодействие бис-ретинилиден этаноламина (А2Е) с бислойными липидными мембранами в темноте и при действии света. Биологические мембраны 22:361-369.

6. Pashkovskaya,A.A., E.A.Sokolenko, V.S.Sokolov, E.A.Kotova, Y.N.Antonenko. 2007.

Photodynamic activity and binding of sulfonated metallophthalocyanines to phospholipid membranes:

Contribution of metal-phosphate coordination. Biochim. Biophys. Acta 1768:2459-2465.

7. Sokolenko, E. A., Pashkovskaya, A. A., Kotova, E. A., Sokolov, V. S., Antonenko, Yu. N.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»