WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

1ч. 30 мин. и 2ч. 40 мин были получены две смеси с разным соотношением А2Е и его эпоксиформ. Они различались по спектрам поглощения, которые представлены на рисунке 4 А вместе со спектром исходного А2Е. Кинетика адсорбции и фотоиндуцированного изменения потенциала этих образцов, а также, для сравнения – исходного А2Е, приведена на рисунке 4,Б.

А Б 0.свет 0.свет 0.A2E свет 0.0.300 400 500 -50 0 50 100 150 200 t, мин Длина волны, нм b, мВ Рис. 4. Спектры поглощения (А) и изменение потенциала на границе мембрана/раствор при адсорбции (Б) для нативного А2Е (1), подверженного облучению 1ч.30 мин.(2), и подверженному облучению 2ч. 40 мин (3).

Как видно из рисунка, адсорбция образцов, предварительно экспонированных светом (кривые 2 и 3), дает меньший адсорбционный потенциал, чем исходный препарат А2Е (кривая 1). Чем больше была длительность предварительного облучения, тем меньше было изменение граничного потенциала. Освещение БЛМ приводило к дальнейшему уменьшению граничного потенциала, которое, по-видимому, вызвано дальнейшим образованием эпокси-форм А2Е в мембране и их десорбцией с ее поверхности.

Причины возрастания потенциала на начальных стадиях освещения (рис.2) не вполне ясны. Можно предположить, что освещение мембраны вызывает образование промежуточной формы окисления А2Е, которая затем превращается в эпокси-форму. Увеличение потенциала при образовании промежуточной формы окисления А2Е под действием света может быть вызвано либо увеличением плотности заряда на поверхности мембраны, либо изменением дипольного потенциала. Для того, чтобы проверить, происходит ли изменение дипольного потенциала, адсорбция А2Е и фотоэффекты изучались в растворах с различной ионной силой фонового электролита. Увеличение ионной силы раствора должно приводить к экранированию заряда и уменьшению поверхностного потенциала, но не может влиять на дипольный потенциал. Поскольку мы показали, что адсорбция А2Е приводит к увеличению поверхностного заряда мембраны, то, как и ожидалось, стократное увеличение ионной силы привело к значительному уменьшению поверхностного потенциала, вызванного адсорбцией.

Фотопотенциал в растворах с высокой ионной силой также уменьшился, причем в той же пропорции, что и потенциал адсорбции. Из этого можно заключить, что увеличение граничного потенциала при освещении в присутствии А2Е вызвано увеличением суммарного поверхностного заряда молекул адсорбированного пигмента, а не дипольного потенциала.

Изучение адсорбции классических ФС на примере фталоцианинов.

Второй раздел посвящен изучению адсорбции различных аналогов фталоцианина, отличающихся по числу сульфогрупп и ассоциированному иону металла (рис.5) на мембранах различного липидного состава. Это исследование позволило определить роль гидрофобных и ковалентных взаимодействий в адсорбции ФС на липидной мембране.

Рис. 5 Структура фталоцианинов. В нашей работе «Me» - Al, Zn либо Ni.

На первом этапе работы мы выясняли влияние на адсорбцию иона металла, ассоциированного в молекуле фталоцианина. В эксперименте использовали AlPcS4, ZnPcS4, NiPcS4.

Из кинетики изменения потенциала после добавления 100 мкM AlPcS4 и 100 мкM ZnPcS(рис. 6) к мембране, сформированной из DPhPC, видно, что оба фталоцианина адсорбируются на мембране и индуцируют появление на ее поверхности отрицательного заряда.

A 60 Б NaF 20 NaF MePcS0 20 40 60 80 0100 200 t, мин MePcS4, мкМ Рис 6. А Кинетика изменения граничного потенциала при адсорбции ZnPcS4 (1) и AlPcS4 (2) на фосфолипидной БЛМ и эффект NaF. Б Зависимость граничного потенциала от концентрации ZnPcS4 (1), AlPcS4 (2) и NiPcS4 (3).

b b, мВ -, мВ Последующая добавка фторида натрия (10 мМ) практически полностью убирала изменение граничного потенциала b, вызванного адсорбцией AlPcS4 (рис. 6, A (2)), но лишь незначительно уменьшала значение изменение граничного потенциала, наблюдаемое после добавки ZnPcS4 (рис.6, А (1)). Эти результаты согласуются с данными, полученными ранее, демонстрирующими ингибирование фторидом связывания AlPcS4 с искусственной, клеточной мембранами и белками. Сродство, то есть степень связывания с DPhPC мембраной, было выше для ZnPcS4 чем для AlPcS4, что видно из зависимостей изменения граничного потенциала b от концентрации фталоцианинов в растворе (рис. 6, Б). Аналогичные измерения, выполненные с NiPcS4 показали, он практически не связывается с БЛМ из DPhPC (рис. 6, Б (3)).

Если БЛМ сформирована из липидов, не содержащих фосфатных групп, связывания с ней фталоцианинов не происходит. Это иллюстрирует рисунок 7, где показана кинетика изменения b, при добавке 100 мкМ AlPcS4 или ZnPcS4 к мембране, сформированной из глицерилмоноолеата (GMO). Отсутствие сколь-либо значительного изменения граничного потенциала указывает на то, что как AlPcS4, так и ZnPcS4 не связываются с мембраной, сформированной из GMO. Способность адсорбироваться на БЛМ из фосфолипидов и отсутствие адсорбции на БЛМ из GMO являются уникальными свойствами фталоцианинов. Для других соединений, например, бенгальского розового, присутствие в составе БЛМ фосфолипидов не является необходимым условием для их адсорбции, что демонстрирует кинетика изменения потенциала на БЛМ из GMO на рис.7. В совокупности эти эксперименты свидетельствуют о том, что связывание фталоцианинов с БЛМ происходит благодаря образованию координационной связи между атомом металла и фосфатными группами мембранообразующих липидов. Фторид конкурирует с фосфолипидом за образование связи с атомом металла, что объясняет уменьшение адсорбционного потенциала после добавки NaF.

2,5 мкМ бенгальский розовый 100 мкМ AlPcS50 мкМ ZnPcS-010 20 t, мин Рис 7. Связывание бенгальского розового, AlPcS4 и ZnPcS4 с БЛМ из GMO, измеренного по разности граничных потенциалов. Водный раствор содержал 100mMKCl, 10 mM Hepes, pH 7,75.

Как было показано ранее (Рокитская, Т.И. и др., 2000) связывание фталоцианинов с липидной мембраной является необходимым фактором для фотодинамического воздействия на мишени, локализованные в или на мембране. Это было доказано на примере фотодинамической инактивации ионных каналов, образуемых пентадекапепдидным грамицидином А (gA) в липидной мембране. Примечательно, что результаты наших экспериментов по изучению адсорбции фталоцианинов на БЛМ полностью согласуются с результатами работы, выполненной рабочей группой Антоненко Ю.Н., по фотоинактивации грамицидиновых каналов (gA) этими же фталоцианинами. Из записи элетрических токов сквозь БЛМ, индуцированных gA, было замечено, что освещение видимым светом БЛМ вызывает уменьшение тока в присутствие фотосенсибилизаторов, причем наиболее эффективным оказался цинковый фталоцианин, в то время как с никелевым фиалоцианином фотоинактивации грамицидиновых каналов не наблюдалось. Увеличение концентрации хлорида калия в случае экспериментов на DPhPC мембране никак не сказывалось на фотоинактивации грамицидиновых каналов AlPcS4, но добавка фторида калия полностью убирала фотоэффект. При проведении подобных экспериментах на мембранах из GMO, фотоактивность AlPcS4 полностью отсутствовала, в то время как добавка к системе красителя бенгальского розового восстанавливала фотоинактивацию грамицидиновых каналов.

b, мВ Полученные результаты свидетельствуют о том, что адсорбция фталоцианинов на БЛМ в значительной степени определяется координационной связью между атомом металла в молекуле фталоцианина и фосфатом в молекуле липида в составе БЛМ.

Кроме атома металла в молекуле фталоцианинов, граничный потенциал, образуемый при их адсорбции на БЛМ, зависел также от числа сульфогрупп в их молекуле (рис.8).

AlPcSAlPcS60 --AlPcS40 AlPcS----AlPcSAlPcS-------1E-7 1E-6 1E-1E-6 1E-5 1E-1E-6 1E-5 1E-C, M C, M C, M Рис 8. Зависимость граничного потенциала от концентрации фталоцианинов. AlPcS1, AlPcS2 (A), AlPcS3, AlPcS4 (B). Водный раствор содержал 100mMKCl, 10 mM Hepes, pH 7,75.

По мере уменьшения числа сульфогрупп в молекуле фталоцианина возрастает вклад дипольной составляющей граничного потенциала, возникающего при адсорбции фталоцианина на БЛМ. В случае моносульфированного фталоцианина граничный потенциал оказывается чисто дипольным. Если сравнить наши данные по эффективности адсорбции разносульфированных AlPcSn, где n варьировал от 1 до 4 с данными по фотоинактивации gA этими же фталоцианинами (Рокитская, Т.И. и др., 2000), то мы так же обнаруживаем четкую корреляцию.

В случае тетрасульфированного фталоцианина (рис. 9), потенциал зависел от ионной силы, причем потенциал, измеренный нами на БЛМ методом КВП, совпадал с -потенциалом, измеренным в тех же условиях на липосомах (Рокитская, Т.И. и др., 2000). Это доказывает, что потенциал возникает в диффузном электрическом слое вследствие появления на поверхности мембраны заряда, вызванного адсорбцией молекул фталоцианина. Оказалось, что зависимости потенциала от концентрации фталоцианина в растворе при разных значениях ионной силы (рис. 9) могут быть описаны теорией Гуи-Чепмена в предположении, что на поверхности БЛМ происходит адсорбция 4-валентных анионов. Для этого использовалось уравнение, связывающее суммарный заряд адсорбированных молекул фталоцианина на поверхности БЛМ с их концентрацией в растворе Ca (изотерма адсорбции Генри):

b b b, мВ, мВ, мВ zFb RT = zKCae и уравнение Гуи-Чепмена:

Fs = sh 2RT 80RTc, где с1 - концентрация раствора KCl,, 0, - диэлектрическая проницаемость водного раствора и вакуума, R - газовая постоянная T - абсолютная температура (299К),F – число Фарадея, z – заряд иона.

Параметр K устанавливает отношение между концентрацией AlPcS4 в воде с его концентрацией на поверхности мембраны. Его значение 200 Кл см моль-1 было найдено с помощью аппроксимации экспериментальных данных теоретическими кривыми методом наименьших квадратов.

0.01 M KCl 0.1 M KCl 10 AlPcS4, мкМ Рис 9. Влияние ионной силы на потенциад адсорбции AlPcS4 фталоцианина. Пустые кружки - 0,01 М KCl, заштрихованные кружки - 0,1 М KCl. Стандартные отклонения каждой точки изображены вертикальными чертами и рассчитывались по минимум пяти экспериментам на каждую точку.

Изучение транспорта синглетного кислорода через БЛМ.

b, мВ В третьем разделе представлена работа по изучению фотодинамического окисления флорицина и транспорта синглетного кислорода через мембрану.При выяснении механизма разрушения клеток при применении фотосенсибилизаторов в медицине важным вопросом является определение доступности компонентов клетки для синглетного кислорода, образующемуся при возбуждении фотосенсибилизатора. Очевидно, что эффективность фотосенсибилизаторов зависит от проницаемости мембраны для синглетного кислорода, что недостаточно изучено из-за недостатка методов определения проницаемости. В настоящей работе предложен метод определения проницаемости мембраны для синглетного кислорода по степени асимметрии фотодинамической реакции разрушения мишеней, расположенных по обе стороны мембраны. Если фотосенсибилизатор находится на одной границе мембраны, синглетный кислород, образующийся при его возбуждении, может поражать мишень на той же стороне мембраны. Если мишень находится с противоположной стороны мембраны, скорость ее разрушения зависит от проницаемости мембраны для синглетного кислорода, которая таким образом может быть измерена по различию скорости окисления мишеней на противоположных границах мембраны.

Эта идея была реализована в работе (Sokolov, V.S. and Pohl, P 2008) на примере фотодинамической реакции окисления флорицина, который является аналогом широко известного дипольного модификатора флоретина, но в отличие от него не способен проникать через мембрану (Соколов, В.С и др., 1984). Известно, что электронейтральные молекулы флорицина, адсорбируясь на БЛМ, создают на ее границе дипольный скачок потенциала, который можно измерить методом КВП (Соколов, В.С. и др., 1984). При введении флорицина в раствор с одной стороны БЛМ возникает разность граничных потенциалов (рис. 10).

Одностороннее добавление в ячейку фталоцианина также приводило к появлению разности граничных потенциалов (см. раздел 2). Граничные потенциалы, создаваемые флорицином в отсутствие фталоцианина, так же как фталоцианином в отсутствие флорицина, при освещении не менялись. Однако, если в ячейке присутствовали одновременно фталоцианин и флорицин, то освещение приводило к уменьшению граничного потенциала, созданного флорицином.

Фотоэффекты были различными в зависимости от того, находились ли флорицин и фталоцианин в одном отсеке ячейки (цис-фотоэффект), или в разных отсеках (трансфотоэффект). На рисунке 10 показана типичная кинетика транс-фотоэффекта, наблюдаемого на мембране, сформированной методом Мюллера-Рудина.

флорицин -темнота -AlPcS-свет -050 100 t, мин Рис.10. Кинетика изменения граничного потенциала, наблюдаемого при так называемом транс-фотоэффекте на мембране, сформированной методом Мюллера-Рудина, диаметр отверстия 1, 5 мм. Водный раствор содержал 100mMKCl, 10 mM Hepes, pH 7,75.

В транс-конфигурации молекулы фталоцианина и флорицина не могут непосредственно взаимодействовать друг с другом, поскольку находятся на противоположных границах мембраны и не могут проникать через нее. Поэтому транс-фотоэффект можно объяснить, только предположив, что в реакции разрушения флорицина участвуют молекулы синглетного кислорода, образующиеся при освещении фталоцианина и способные проникать через мембрану. Предположение об участии в реакции синглетного кислорода подтверждается экспериментами. Было показано, что фотоэффект подавляется азидом натрия, который является тушителем синглетного кислорода. Более сильным ингибитором оказался убихинон Q2. На БЛМ, сформированной из смеси фосфатидилхолина с убихиноном, фотоэффект в трансконфигурации ослаблялся, причем величина ослабления была эквивалентна ослаблению освещения в десять раз (Sokolov, V.S. and Pohl, P, 2008). Возможно, убихинон оказался столь эффективным потому, что он является липидорастворимым соединением и способен тушить синглетный кислород внутри мембраны, в то время как азид натрия является водорастворимым соединением и реагирует с синглетным кислородом преимущественно в водном растворе. В цис-конфигурации, где синглетный кислород не должен проникать через мембрану, чтобы реагировать с флорицином, убихинон не ослаблял фотоэффект. Количественно фотоэффект был измерен по относительной скорости изменения граничного потенциала в момент начала освещения R и по предельному изменению потенциала V при бесконечной длительности b, мВ освещения. Эти параметры определялись с помощью аппроксимации зависимости граничного потенциала от времени суммой двух экспонент.

db b t=0 - b t dt R = ; V =.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»