WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

Молекулярные методы, хотя и обладают высокой разрешающей способностью, но также зависят от целого ряда факторов, влияющих на конечный результат. Критическими являются: эффективность выбранного метода выделения ДНК, результативность работы праймерной системы, наличие гена-мишени у исследуемых микроорганизмов (в нашем случае отсутствие pmoA у Methylocella не позволило обнаружить данную бактерию в исследованных накопительных культурах). Ограниченность базы данных также часто не позволяет проводить идентификацию микроорганизмов, о чем свидетельствует большое число последовательностей генов «некультивируемых» или неидентифицированных микроорганизмов. Следовательно, только параллельное использование нескольких экспериментальных подходов позволяет получить наиболее полные данные о составе исследуемого сообщества.

4.Анализ диазотрофного сообщества кислой торфяной почвы сфагнового верхового болота.

До сих пор практически отсутствуют работы, посвященные определению биоразнообразия диазотрофов в кислых болотных почвах и выявлению их азотфиксирующего потенциала. Нами было изучено разнообразие азотфиксаторов в образцах кислой торфяной почвы сфагнового верхового болота (п. Сосвятское, Тверская область) с помощью анализа последовательностей гена nifH и проведено сравнение наших результатов с данными ИФА, полученными коллегами из ИНМИ. Для молекулярного анализа состава диазотрофного сообщества суммарная ДНК была выделена из образцов торфа, взятых с глубины 10-20 см, на которой была показана наибольшая азотфиксирующая активность (Кравченко и Дорошенко, 2003). С использованием универсальных праймеров F1 и R6 было получено и проанализировано 136 клонов, содержащих вставку генов nifH. Эти клоны были разделены на 25 различных групп (сиквенс-типов) и был проведен поиск близкородственных последовательностей в базе данных GenBank. В результате этого анализа мы смогли определить таксономическую принадлежность ряда выявленных последовательностей на уровне рода.

Так, транслированные аминокислотные последовательности генов nifH диазотрофов сиквенс-типа SB-1 были наиболее близкими с аналогичной последовательностью гена nifH ацидофильной метанотрофной бактерии Methylocella palustris (98% уровень гомологии). На дендрограмме представители этого сиквенс-типа образовали общий кластер с данным микроорганизмом. Сиквенс-тип SB-2 был близким к представителям рода Azospirillum (уровень гомологии транслированных аминокислотных последовательностей - 95%). Для кислых торфяных почв этот факт был отмечен впервые и послужил основой для выделения в чистую культуру и описания нашими коллегами из ИНМИ (Дорошенко и др., 2006) новых штаммов Azospirillum lipoferum. Сиквенс-типы SB-3, SB-4, SB-5 оказались довольно близки между собой (уровень гомологии транслированных аминокислотных последовательностей - 92-97%). На дендрограмме (рис. 5) они образовали отдельный кластер внутри группы -Протеобактерий. Сиквенс-тип SB-6 оказался наиболее близким к представителям рода Methylocystis из группы метанотрофных бактерий II типа (93% гомологии транслированных аминокислотных последовательностей). Транслированные аминокислотные последовательности генов nifH сиквенс-типа SB-7 были близки к аналогичным последовательностям генов nifH представителей рода Bradyrhizobium (99% гомологии). На дендрограмме эта группа клонов и представители данного рода образовали общий кластер.

Сиквенс-типы SB-8 — SB-13 образовали отдельный кластер внутри группы - Протеобактерий, наиболее близкий к представителям метанотрофов I типа из рода Methylobacter. Однако, достаточно низкий уровень гомологии (83-88%) между транслированными аминокислотными последовательностями клонов и аналогичными последовательностями представителей различных родов из -Протеобактерий не позволяет их точно идентифицировать. Вероятно, в исследуемом микробном сообществе кислой торфяной почвы сфагнового верхового болота присутствует несколько различных видов до сих пор не описанных бактерий. Возможно также, что часть этих клонов относится к известным видам, последовательности генов nifH которых пока не представлены в базе данных. Ранее с помощью ИФА, (И.К. Кравченко, устное сообщение), в данном микробном сообществе было показано присутствие метанотрофных бактерий I типа в незначительном количестве (4-5% от общего количества прокариот). Как и в случае минорных компонентов в накопительных культурах, мы также не смогли выявить этих бактерий, тем более что, по мнению ряда исследователей, предел чувствительности молекулярных подходов составляет около 5% (Bodrossy et al., 2003). Это еще раз подтверждает необходимость параллельного использования нескольких методов для исследования микробных популяций.

0. SB-SB-SB-SB- Methylocystis echinoides Methylocystis minimus SB-Bradyrhizobium japonicum Bradyrhizobium elkanii Beijerinckia indica -PB Methylocapsa acidiphila Methylocystis methanolicus Methylococcus capsulatus Methylocella silvestris SB-Methylocella palustris Azospirillum lipoferum Azospirillum brasilense SB-75 Gluconacetobacter diazotrophicus Rhizobium sp.NGRHalorhodospira abdelmalekii Halorhodospira halochloris Methylomonas methanica Methylomonas rubra Klebsiella pneumoniae Azotobacter chroococcum Ectothiorhodospira vacuolata Thiocapsa roseopersicina -PB Methylobacter chroococcum Methylobacter bovis Methylobacter psychrophillus SB- SB-SB-SB-97 SB-SB-Geobacter metallireducens -PB 99 SB-Pelobacter propionicus SB-Oscillochloris trichoides R АНФБ SB-Oscillochloris trichoides DgSB-98 SB-К SB-л Desulfovibrio vulgaris 99 а Pelodictyon luteum Chlorobium tepidum с Chlorobium sp.Macesta т Prosthecochloris vibrioformis е 95 SB-р SB-Desulfovibrio gigas SB-III SB-52 SB-SB-Methanosarcina barkeri Рисунок 5. Дендрограмма, построенная на основе сравнительного анализа транслированных последовательностей фрагментов генов nifH. Клоны, полученные в данном исследовании, выделены жирным шрифтом. Масштаб соответствует 10 заменам на 100 аминокислотных остатков (эволюционным расстояниям). Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью «bootstrap»-анализа 500 альтернативных деревьев.

Довольно часто при анализе природных микробных сообществ диазотрофов обнаруживается большое количество неидентифицируемых микроорганизмов, входящих именно в -подкласс Протеобактерий. Это было отмечено при изучении ризосферы риса (Ueda et al., 1995) и различных почвенных сообществ, а среди азотфиксаторов океана неидентифицируемые микроорганизмы, принадлежащие -Протеобактериям вообще составляют основной филотип (Zehr et al., 1998; Bird et al., 2005). В нашем исследовании мы также не смогли точно идентифицировать ни один клон из группы -Протеобактерий.

Сиквенс-тип SB-14 оказался близким к представителю -Протеобактерий Pelobacter propionicus из семейства Geobacteraceae (степень сходства между транслированными аминокислотными последовательностями составила 96%). На дендрограмме SB-14 и P.

propionicus образовали общий кластер.

Сиквенс-типы SB-15 и SB-16 обнаружили наибольшее сходство с представителями группы АНФБ из рода Oscillochloris. Присутствие таких микроорганизмов в кислой торфяной почве (pH 3.5-4.2) было показано нами впервые. Уровень гомологии между транслированными аминокислотными последовательностями генов nifH Osc. trichoides и других известных азотфиксаторов составляет менее 74%, поэтому высокий уровень гомологии между сиквенс-типами SB-15, SB-16 и Osc. trichoides (97%) c большой долей вероятности может свидетельствовать о присутствии данного микроорганизма в исследуемом микробном сообществе. Дополнительное исследование, проведенное в нашей лаборатории, подтвердило присутствие в данном местообитании микроорганизмов, близких к роду Oscillochloris.

Представители остальных 9 сиквенс-типов (SB-17 – SB-25) оказались близки к азотфиксаторам, относящимся к так называемому кластеру 3 (Zehr et al., 2003). Этот кластер включает последовательности генов nifH отдаленных групп микроорганизмов, большинство из которых строгие анаэробы (сульфатредуцирующие микроорганизмы, зеленые серные прокариоты, клостридии). Все полученные в нашем исследовании сиквенстипы из кластера 3 не обнаружили близкого родства с идентифицированными микроорганизмами, уровень гомологии транслированных аминокислотных последовательностей составил менее 90%. Кроме того, уровень гомологии последовательностей полученных клонов в большинстве случаев был одинаков с аналогичными последовательностями, как представителей группы зеленых серных микроорганизмов, так и представителей рода Desulfovibrio. Этот факт уже был отмечен и другими авторами при исследовании различных диазотрофных природных сообществ (Ueda et al., 1995; Ohkuma et al., 1999; Zani et al., 2000; MacGregor et al., 2001).

Микроорганизмы из данного кластера, видимо, очень широко распространены в анаэробных или микроаэробных экологических нишах разных природных сообществ, однако точно идентифицировать их пока не представляется возможным.

Таким образом, в ходе нашего исследования мы выявили в образцах кислой торфяной почвы сфагнового верхового болота значительное разнообразие азотфиксирующих микроорганизмов, принадлежащих к различным филогенетическим группам. Полученные данные противоречат распространенному мнению о невысоком биоразнообразии микробных сообществ кислых торфяных почв и могут способствовать выделению и описанию новых микроорганизмов, а также применяться в дальнейших комплексных исследованиях болотных сообществ.

ВЫВОДЫ:

1. Разработан метод выделения ПЦР-пригодных препаратов ДНК из почв, существенно различающихся по своим физико-химическим характеристикам, в том числе с низкими значениями pH и богатых органическими веществами.

2. Существенно расширена база данных последовательностей генов nifH для ряда фототрофных микроорганизмов, и проведен их филогенетический анализ. По результатам анализа можно предположить, что некоторые нуклеотидные последовательности генов nifH некультивируемых микроорганизмов, представленные в базе данных GenBank, принадлежат фотосинтезирующим микроорганизмам.

3. На примере модельной системы метанотрофных накопительных культур показано, что результаты анализа генов nifH могут быть использованы для оценки биоразнообразия смешанных культур. Однако только одновременное использование нескольких методов позволяет получить более полные данные о составе исследуемых сообществ.

4. Впервые исследовано биоразнообразие азотфиксирующих прокариот в микробном сообществе кислой торфяной почвы сфагнового верхового болота. Впервые в кислой торфяной почве показано присутствие микроорганизмов, близких к Oscillochloris и Azospirillum.

5. На примере выявления Azospirillum в микробном сообществе торфяной почвы показано, что данные ПЦР-диагностики позволяют уверенно предсказывать наличие тех или иных прокариот в микробном сообществе.

Список работ по материалам диссертации:

1. Запороженко Е.В., Слободова Н.В., Булыгина Е.С., Кравченко И.К., Кузнецов Б.Б.

Экспресс-метод выделения ДНК из бактериальных сообществ различных почв.

Микробиология. 2006. 75 (1), 127-134.

2. Турова Т.П., Спиридонова Е.М., Слободова Н.В., Булыгина Е.С., Кеппен О.И., Кузнецов Б.Б., Ивановский Р.Н. Филогения аноксигенных нитчатых фототрофных бактерий семейства Oscillochloridaceae на основании сравнительного анализа генов rrs, cbbL и nifH. Микробиология. 2006. 75 (2), 235–244.

3. Слободова Н.В., Колганова Т.В., Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Турова Т.П., Кравченко И.К. Сравнительная характеристика метанотрофных накопительных культур с помощью серологических и молекулярных методов. Микробиология. 2006.

75 (3), 397-403.

4. Sizova M.V., Panikov N.S., Spiridonova E.M., Slobodova N.V., Tourova T.P. Novel facultative anaerobic acidotolerant Telmatospirillum siberiense gen. nov. sp. nov. isolated from mesotrophic fen. Syst Appl Microbiol. 2006 Jul 27 (в печати).

5. Slobodova N., Boulygina E., Kuznetsov B., Kravchenko I. Diazotrophic diversity of acid peat soil microbial communities. 6th European Nitrogen Fixation Conference. Toulouse, France, July 24-27, 2004, p. 109 (Abstracts).

6. Слободова Н.В., Булыгина Е.С., Кравченко И.К., Кузнецов Б.Б. Молекулярнобиологический анализ азотфиксирующих бактерий торфяной болотной почвы.

Международная конференция «Экологические проблемы северных регионов и пути их решения». Апатиты, Россия, 31 августа-3 сентября 2004 г. Материалы конференции, ч.2, стр.30.

7. Slobodova N., Kolganova T., Boulygina E., Kuznetsov B., Tourova T., Kravchenko I.

Complex analysis of methanotrophs diversity in mixed cultures isolated from Sphagnum peat bog. 8th International Symposium on Biogeochemistry of Wetlands. Gent, Belgium, Sept 14-17, 2003, p. 30 (Abstracts).

8. Ushakova N.A., Tourova T.P., Slobodova N.V. The gut bacteria of monogastric vertebrate herbivores, participating in cellulose destruction during the nitrogen deficiency. 9th International Symposium on Nitrogen Fixation with Non-Legumes. Leuven, Belgium, Sept 1-5, 2002, p.163 (Abstracts).

9. Slobodova N., Boulygina E., Kuznetsov B., Tourova T., Marusina A., Kravchenko I. The application of universal nifH primers for analysis of N2-fixing bacteria. 9th International Symposium on Nitrogen Fixation with Non-Legumes. Leuven, Belgium, Sept 1-5, 2002, p.48 (Abstracts).

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»