WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Таблица 1. Характеристики препаратов ДНК, выделенных из микробных сообществ различных типов почв с помощью четырех буферных растворов.

Тундровая, торфяно-глеевая почва (Воркута, февраль 2004) буфер 1 буфер 2 буфер 3 буфер A260/A280 1,80±0,21 1,92±0,30 1,97±0,21 1,69±0,Кол-во ДНК на 1 г почвы, мкг 2,10±0,09 0,60±0,07 1,50±0,09 1,50±0,Серая лесная, суглинистая почва смешанного леса (Московская обл., г. Пущино, ноябрь 2003) буфер 1 буфер 2 буфер 3 буфер A260/A280 1,74±0,26 1,38±0,22 1,63±0,20 1,61±0,Кол-во ДНК на 1 г почвы, мкг 1,90±0,10 2,00±0,10 1,40±0,10 2,90±0,Торфяная почва (Тверская обл., п. Сосвятское, октябрь 2003) буфер 1 буфер 2 буфер 3 буфер A260/A280 1,35±0,57 1,28±0,46 1,53±0,38 1,57±0,Кол-во ДНК на 1 г почвы, мкг 0,18±0,06 0,21±0,06 0,17±0,05 0,23±0,Все полученные препараты были проверены на пригодность к ПЦР-анализу и были использованы для получения как практически полной ПЦР-копии гена 16S рРНК (п.н.), так и его фрагмента (508 п.н.) (рис. 2).

А.

1481 п.н.

508 п.н.

Б.

1481 п.н.

508 п.н.

В.

1481 п.н.

508 п.н.

Рисунок 2. Амплификация фрагментов генов 16S рРНК на препаратах ДНК, выделенных различными методами из микробных бактериальных сообществ: А - торфяно-глеевой почвы (г.

Воркута); Б - серой лесной почвы (г. Пущино, Московская обл.); В - торфяной почвы (п.

Сосвятское, Тверская обл.). Стрелкой указан целевой фрагмент (слева – размер фрагмента п.н., справа – 508 п.н.). Цифрами обозначены: 1 –маркер молекулярной массы ДНК; 2,3,4 – ДНК, выделенная способом 1; 5,6,7 – ДНК, выделенная способом 2; 8,9,10 – ДНК, выделенная способом 3; 11,12,13 – ДНК, выделенная способом 4; 14 – ДНК Escherichia coli (положительный контроль);

15 – Контроль в отсутствии ДНК матрицы.

В результате сопоставления этих данных со степенью чистоты препаратов ДНК (соотношение А260/А280; в чистых препаратах >1,75) и выходом ДНК из 1 г почвы для дальнейшей работы был выбран способ 3 как наиболее оптимальный. Он был дополнительно протестирован на образцах 7 типов почв, существенно отличающихся по своим физико-химическим характеристикам и полученным как из интактных природных экосистем, так и из мест с повышенной антропогенной нагрузкой. Анализ результатов показал, что выбранным способом (№ 3) удается получить препараты ДНК приемлемой чистоты (соотношение А260/А280 варьировало от 1,47 до 1,97) для всех проанализированных типов почв, включая торфяную и торфяно-глеевую почвы, выделение ДНК из которых осложнено низкими значениями величин pH (3.9 и 5.0, соответственно) и высоким содержанием органических веществ. В результате проведения амплификации было показано, что препараты ДНК, полученные с помощью буфера 3, пригодны для получения ПЦР-фрагментов как частичного, так и практически полного гена 16S рРНК (рис. 3).

А.

1481 п.н.

Б.

508 п.н.

Рисунок 3. Амплификация фрагментов генов 16S рРНК на препаратах ДНК, выделенных способом 3 из бактериальных сообществ различных типов почв. Стрелкой указан целевой фрагмент. А – размер фрагмента 1481 п.н., Б – размер фрагмента 508 п.н.

Цифрами обозначены: 1–маркер молекулярной массы ДНК; 2, 3 – ДНК, выделенная из суглинистой пахотной почвы (Жирона, Испания); 4, 5 – ДНК, выделенная из суглинистой пахотной почвы (Гистель, Бельгия); 6, 7 – ДНК, выделенная из супесчаной пахотной почвы (Беллем, Бельгия); 8, 9 – ДНК, выделенная из супесчаной аллювиальной почвы (Стелленбош, ЮАР); 10 – ДНК, выделенная из суглинистой пахотной почвы (Пущино, Моск. обл.); 11 - ДНК, выделенная из суглинистой лесной почвы (Жирона, Испания); 12 - ДНК, выделенная из тундровой, торфяно-глеевой почвы (Воркута); 13 – ДНК, выделенная из торфяной почвы (п. Сосвятское, Тверская обл.); 14 - ДНК, выделенная из суглинистой лесной почвы (Пущино, Моск.

обл.); 15 – ДНК, выделенная из суглинистой луговой почвы (Пущино, Моск. обл.); 16 – ДНК Escherichia coli (положительный контроль); 17 – Контроль в отсутствии ДНК матрицы.

2. Изучение последовательностей генов nifH у различных микроорганизмов.

В исследованиях различных природных диазотрофных сообществ всегда обнаруживается большое количество неидентифицируемых прокариот. Это в значительной степени обусловлено ограниченностью базы данных для культивируемых микроорганизмов. Расширение базы данных последовательностей генов nifH для культивируемых азотфиксаторов способствует более полной идентификации микроорганизмов при исследовании природных сообществ. База данных последовательностей генов nifH для ряда групп аноксигенных фототрофных бактерий была невелика, тогда как эти прокариоты очень широко распространены в природе и имеют высокое экологическое значение. На начало нашего исследования фототрофные микроорганизмы, относящиеся к группе -Протеобактерий в базе данных GenBank были представлены единственной последовательностью фрагмента гена nifH Marichromatium purpuratum. Последовательности генов nifH группы АНФБ вообще отсутствовали, несмотря на то, что у представителей рода Oscillochloris была отмечена способность к азотфиксации (Кеппен, 1989). В данном исследовании были определены последовательности генов nifH 21 представителя фототрофных микроорганизмов, находящихся в коллекциях ИНМИ и кафедры микробиологии МГУ. Среди этих бактерий были представители 4 родов -Протеобактерий (Phaeospirillum, Rhodoblastus, Rhodoplanes, Rhodovulum), 5 родов -Протеобактерий (Allochromatium, Thiocapsa, Ectothiorhodospira, Thiorhodospira, Halorhodospira), а также представитель -Протеобактерий из рода Rubrivivax. Кроме того, впервые были получены последовательности генов nifH Osc.

trichoides (штаммы КР, Р, Dg6) из группы АНФБ.

Сравнительный анализ полученных последовательностей показал, что некоторые ранее неидентифицированные клоны из природных сообществ, представленные в базе данных GenBank, относятся к фототрофным бактериям.

3. Сравнение молекулярных, серологических и микроскопических методов для характеристики микробных сообществ.

Очень часто исследования природных микробных сообществ проводят с использованием какого-либо одного молекулярного ДНК-маркера. Однако изучение сложных природных систем требует комплексного подхода, поэтому при исследовании состава модельного микробного сообщества мы использовали несколько методов:

микроскопический, иммунологический и молекулярный, с целью сравнения их эффективности.

В качестве модельного объекта исследования нами были выбраны метанокисляющие накопительные культуры (SB26, SB31, SB31А), выделенные из торфяной почвы верхового болота Сосвятское. Все культуры обладали растворимой метанмонооксигеназой (рMMO) (нафталеновый тест). Культура SB31 обладала интенсивным розово-оранжевым пигментом, тогда как у культуры SB26 такая пигментация отсутствовала. Культура SB31A - производная культуры SB31, утратившая пигментацию.

Преимуществом накопительной культуры для исследования такого рода является то, что в ней искусственно ограничено количество компонентов по сравнению с естественным природным сообществом. Это позволяет проводить более точный анализ состава сообщества. Данная работа была проведена совместно с коллегами из ИНМИ.

3.1. Микроскопический и серологический анализ. При проведении электронномикроскопического анализа по признаку наличия хорошо развитых внутриклеточных мембран в одной накопительной культуре (SB26) было выявлено присутствие только метанотрофов II типа, а в двух других (SB31 и SB31А) – I и II типов. Таким образом, этот анализ позволил сделать предварительное заключение о составе исследуемых сообществ.

Для иммунофлуоресцентного анализа (ИФА) были использованы видоспецифичные сыворотки, и по результатам проведенного исследования (Слободова и др., 2006) удалось не только выявить присутствие метанотрофов I и II типов, но и провести их видовую диагностику (табл. 2). Так, в культуре SB26 было установлено наличие метанотрофов только II типа: Methylosinus trichosporium и Methylocystis echinoides. В культурах SB31 и SB31A были обнаружены метанотрофы как I, так и II типа: Ms.

trichosporium, Methylococcus capsulatus и Methylomonas methanica были выявлены в культуре SB31, а Ms. trichosporium и Mc. capsulatus - в культуре SB31A.

3.2. Молекулярный анализ. Молекулярный анализ проводили независимо по двум типам функциональных генов – pmoA и nifH. Метанмонооксигеназа (MMO) является ключевым ферментом окисления метана метанотрофами. В настоящее время выявлены две ферментные системы: растворимая (sMMO) и мембраннсвязанная (pMMO). pMMO, в отличие от sMMO, присутствует во всех известных метанотрофах, кроме Methylocella (Dedysh et al., 2000). Наиболее часто в экологических исследованиях используют анализ последовательностей гена pmoA, кодирующего 27 kDa субъединицу рMMO (Holmes et al., 1995), и в нашей работе мы также использовали этот ген для анализа. Результаты исследования генов pmoA в целом согласуются с данными, полученными методом ИФА. С помощью анализа генов pmoA представители рода Methylocystis были выявлены во всех накопительных культурах, а рода Methylomonas – только в SB31. Однако, в отличие от результатов ИФА, Mc. capsulatus в культуре SB31A обнаружен не был.

Присутствие генов нитрогеназного комплекса, в том числе гена nifH, было показано для представителей метанотрофов I и II типов, что позволило нам использовать этот ген в качестве молекулярного маркера (Булыгина и др., 2002). На момент исследования в базе данных GenBank последовательности генов nifH для представителей родов Methylocella и Methylocapsa отсутствовали. Нами были определены последовательности фрагментов генов nifH у Methylocella palustris K2a и Methylocapsa acidiphila В2, что позволило выявить присутствие Methylocella palustris в накопительных культурах и провести, соответственно, более точный анализ состава сообщества.

Суммарно для трех накопительных культур было получено 176 клонов, содержащих вставку фрагментов генов nifH. Результаты анализа генов nifH в целом согласуются с данными, полученными серологическим методом и исследованием генов pmoA. Анализ полученных клонов показал, что часть из них оказалась наиболее близкой к метанотрофам II типа из рода Methylocystis (98-99% сходства транслированных аминокислотных последовательностей). В накопительной культуре SB26 клон 26-4n проявил наибольшее сходство с Mcs. echinoides (99% сходства транслированных аминокислотных последовательностей), а клоны 26-3n и 26-5n – с Mcs. minimus (98 и 99% сходства, соответственно). На дендрограмме, построенной на основе транслированных последовательностей генов nifH, все эти клоны образовали компактный кластер с Mcs.

minimus и Mcs. echinoides (рис. 4). В накопительной культуре SB31 клоны 31-5n и 31A-1n обнаружили наибольшее сходство с Methylocella palustris (100 и 97% сходства транслированных аминокислотных последовательностей, соответственно). На дендрограмме эти клоны образовали общий кластер с Methylocella palustris, а клон 31-3n группировался с Azospirillum brazilensis (97% сходства транслированных аминокислотных последовательностей) и Rhizobium phaseoli (95% сходства).

.

0.клон 31-4n клон 31-2n клон 31-1n клон 31A-2n клон 31-6n клон 26-1n A клон 26-2n l Methylocystis minimus f клон 26-5n a клон 26-3n клон 26-4n P Methylocystis echinoides r Bradyrhizobium elkanii o Methylocapsa acidiphila Bt Beijerinckia indica Methylocystis sp.LW2 e Methylocystis sp.LW5 o 74 Methylocystis methanolicus 10 b Methylosinus trichosporium a Methylosinus trichosporium OB3B c Methylosinus sporium t Methylococcus capsulatus e Methylococcus capsulatus r Methylocystis parvus i Methylocella silvestris BLa клон 31-5n (PB) клон 31A-1n Methylocella palustris K2A 96 клон 31-3n Rhizobium phaseoli Azospirillum lipoferum Azospirillum brasilense Methylomonas methanica S1T G Methylomonas rubra a Methylomonas methanica m 100 Methylobacter bovis m Methylobacter marinus Aa Methylobacter vinelandii Methylobacter chroococcum P Paenibacillus polymyxa B Рисунок 4. Дендрограмма, построенная на основе анализа транслированных аминокислотных последовательностей фрагментов генов nifH.

Последовательности, полученные в данной работе, выделены жирным шрифтом.

Масштаб соответствует 10 заменам на 100 аминокислотных остатков (эволюционным расстояниям). Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью «bootstrap»-анализа 500 альтернативных деревьев.

В целом результаты, полученные четырьмя методами, дополняют друг друга (табл.

2). Некоторые различия могут быть объяснены несколькими причинами. Во-первых, согласно данным трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ), доля метанотрофов I типа в накопительных культурах была довольно низкой.

Эти результаты согласуются с анализом библиотеки клонов гена pmoA, в которой последовательности, близкие к Methylomonas, составляли менее 4%. Возможно, именно низкая численность метанотрофов I типа явилась причиной того, что нам не удалось обнаружить бактерии рода Methylomonas с помощью анализа генов nifH и Methylococcus с помощью анализа генов nifH и pmoA. Кроме того, высокая степень вырожденности использованных праймеров и разница в эффективности работы праймерной системы на различных матрицах ДНК также могут искажать конечные результаты. И, наконец, хотя перекрестные реакции и видовая специфичность антител были проверены и подтверждены на чистых коллекционных культурах, иммунные характеристики метанотрофов в природных объектах могут отличаться.

Таблица 2. Сравнение результатов анализа состава накопительных культур, полученных с помощью различных методов.

Анализ генов Культура ТЭМ ИФА Анализ генов nifH pmoA Methylocystis echinoides, Метанотрофы Methylosinus trichosporium; Methylocystis SB26 Methylocystis minimus;

II типа Methylocystis echinoides echinoides Methylocystis spp.

Methylocystis Methylosinus trichosporium; Methylocystis echinoides, Метанотрофы echinoides;

SB31 Methylococcus capsulatus; Methylocystis minimus;

I и II типов Methylomonas Methylomonas methanica Methylocella palustris methanica Methylocystis echinoides, Метанотрофы Methylosinus trichosporium; Methylocystis SB31A Methylocystis minimus;

I и II типов Methylococcus capsulatus echinoides Methylocella palustris Таким образом, ТЭМ позволяет выявлять особенности ультратонкой структуры клеток и может давать на этой основе предварительную количественную оценку исследуемого сообщества, однако не позволяет проводить идентификацию микроорганизмов даже на уровне семейства. ИФА дает важную информацию о составе сообщества, но его применение ограничивается наличием соответствующих сывороток.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»