WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Таблица Сравнительная характеристика генов мобилизации (mob) плазмид pAH 36-4CPA и pECOДлина, п.н. Содержание Кодируемый Ген pAH 36-4CPA pECO1 GC-пар, % белок mobA 1497 1502 60.59 MobA mobB 489 492 59.92 MobB mobD 216 213 58.8 MobD mobC 324 324 66.05 MobC Из приведенных данных следует, что размеры mob генов плазмид pAH 36-4CPA и pECO1 имеют различия, в частности, длина генов mobA и mobB pAH 36-4CPA незначительно превышает длину генов mobA и mobB pECO1. В случае mobD наблюдается обратная ситуация, в тоже время последовательности mobC оказываются одинаковыми.

Полученные данные позволяют также сделать вывод о том, что область мобилизации плазмид pAH 36-4CPA и pECO1 имеют сходную структуру. Эта область pAH 36-4CPA устроена таким образом, что 2 гена (mobB и mobD) полностью перекрываются последовательностью гена mobA, в то время как ген mobC перекрывается геном mobA только частично (11 п.н.).

Расположение генов мобилизации (mob) на плазмиде pAH 36-4CPA может быть представлено следующим образом (рис. 3).

Рис. 3. Схема расположения генов мобилизации (mobC, mobA, mobB, mobD) на плазмиде pAH 36-4CPA Citrobacter hydrophila IBRB-36 4CPA.

Филогенетическое положение кластера генов мобилизации плазмиды pAH 36-4CPA Citrobacter hydrophila IBRB-36 4CPA.

Филогенетическое положение кластера генов mob штамма Citrobacter hydrophila IBRB-36 4CPA было определено на основании сравнительного анализа последовательностей в формате ресурсов GenBank. Результаты анализа указали на общее происхождение mob генов плазмид pAH 36-4CPA Citrobacter hydrophila IBRB-36 4CPA, pECO1 Enterobacter cloacae и Aeromonas hydrophila pAH3680 (рис. 4).

Рис. 4. Филогенетическое положение генов мобилизации (mob) плазмиды pAH 36-4CPA Citrobacter hydrophila IBRB-36 4CPA.

Результаты сравнений последовательностей генов mobA, mobB, mobC и mobD плазмиды pAH 36-4CPA Citrobacter hydrophila IBRB-36 4CPA с ресурсами базы данных GenBank приведены в табл. 2.

Из данных табл. 2 можно сделать вывод о том, что наибольший уровень гомологии mob гены плазмиды pAH 36-4CPA обнаруживают с генами плазмиды pECO1 Enterobacter cloacae.

Таблица Результаты сравнительного анализа последовательности нуклеотидов генов mobA, mobB, mobC и mobD плазмиды pAH 36-4CPA с ресурсами GenBank Уровень гомологии в сравнении Плазмида Бактериальный с pAH 36-4CPA, % источник Название № в GenBank mobA mobB mobC mobD Enterobacter pEC01 AB117929.1 99 99 96 cloacae Aeromonas pAH3680 DQ402049.1 98 98 96 hydrophila pEC278 AY589571.1 Escherichia coli 91 н.д. 95 Условные обозначения: н.д. – нет данных.

Вместе с тем сравнение выявило вариабельность некоторых участков последовательностей генов mobA, mobB, mobC и mobD плазмиды pAH 36-4CPA (табл. 3). При этом, как оказалось, замены некоторых нуклеотидов могут привести к изменениям первичной структуры молекул белков MobA, MobB и MobC. Возможные замены аминокислотных остатков приведены в табл. 3.

Приведенные в табл. 3 данные указывают на присутствие единичных замен нуклеотидов в mobA плазмиды pAH 36-4CPA, а именно, в позициях (Ser Thr), 512, 514 (Thr Ala), 563 (Asn Ser).

Кроме этого, в последовательности гена mobA обнаружен сдвиг рамки считывания в 645 позиции, поэтому конец белка MobA, детерминируемый геном mobA плазмиды pAH 36-4CPA, существенно отличается от продукта MobA плазмиды pECO1 Enterobacter cloacae (рис. 2).

Из анализа данных табл. 3 также следует, что в последовательности гена mobB плазмиды pAH 36-4CPA обнаруживаются три нуклеотидные замены в позициях 55, 86, и 104, которые приводят к заменам трех аминокислотных остатков в молекуле белка MobB: Lys Gln, Ala Val, Gln Arg.

В последовательности гена mobС плазмиды pAH 36-4CPA обнаруживаются 9 нуклеотидных замен, 3 из которых, расположенные в положениях 65, 89 и 115, приводят к заменам трех аминокислотных остатков в молекуле белка MobC: Pro Gln, Thr Ile, Thr Ser.

Согласно результатам сравнительного анализа последовательностей нуклеотидов генов mobD и аминокислотных остатков белка MobD в формате базы данных GenBank установлено, что эти последовательности плазмид pAH 36-4CPA pECO1 имеют 100% гомологию.

Из приведенного следует, что можно прогнозировать наличие отличий молекул белков MobA, MobB и MobC, детерминируемых плазмидой pAH 364CPA, от соответствующих белков плазмиды pECO1 Enterobacter cloacae, в то время как белки MobD будут обладать одинаковой структурой.

Таблица Вариабельность нуклеотидов последовательностей генов mobA, mobB, mobC плазмид pAH 36-4CPA и pECO1, приводящая к заменам аминокислотных остатков белков MobA, MobB и MobC Аминокислотные № Нуклеотиды остатки Ген позиции pECO1 pAH 36-4CPA pECO1 pAH 36-4CPA 92 C G Ser Thr 512 G A mobA Thr Ala 514 A T 563 G A Asn Ser 55 C A Lys Gln mobB 86 T C Ala Val 104 G A Gln Arg 65 A C Pro Gln mobC 89 T C Thr Ile 115 T A Thr Ser Условные обозначения:

аминокислоты:

Gln - глутамин, Arg - аргинин, Ala - аланин, Val - валин, Lys – лизин;

Pro – пролин; Thr – треонин;

Ile – изолейцин;

нуклеотиды:

C - цитозин, T - тимин, G – гуанин, A – аденин.

Обсуждая полученные данные, следует отметить, что белки, кодируемые генами mobA, mobB, mobC и mobD обладают различными функциями. Белок MobA является критическим компонентом релаксомы, которая обеспечивает инициирование трансфера ДНК как в конъюгативных, так и в мобилизируемых плазмидах. MobA способен формировать специфический комплекс ДНК, который является удивительно устойчивым, с периодом полураспада приблизительно 95 минут (Zhang S., Meyer, R., 1997). In vitro было показано, что белок MobA способен прочно связываться с перемещаемой цепью ДНК, и плохо - с комплементарной или линейной ДНК. Сайт oriT и окружающие его последовательности требуются для эффективного завершения раунда трансфера. Структура повторов IR, прилегающих к oriT, является наиболее важной для связывания MobA с одноцепочечной ДНК (Becker E.C., Meyer R.J., 2000), при этом ветвь IR, ближайшая к nick-сайту, требуется для разрезания oriT в релаксоме. В этой реакции требуется двухвалентный катион Mg2+, Mn2+, Ca2+ или Ba2+ (Scherzinger E., et al., 1992).

Механизм реализации активности релаксазы плазмиды pMV158 был продемонстрирован in vitro (Guzman L.M., Espinosa M., 1997). Релаксаза pMV158 разрезала ДНК в ник-сайте и оставалась прочно связанной с ДНКмишенью. Белок был способен расщеплять ДНК в суперскрученном или одноцепочечном состоянии, в присутствии Mg2+, предполагается, что реакцию расщепления катализирует Tyr 49. (Selinger L.B., et al., 1990; Grohmann E., et al.,1999).

Хотя белок MobA является самодостаточным для разрыва одноцепочечного ДНК субстрата (Scherzinger E., et al., 1993), для никактивности на двуцепочечной ДНК качестве дополнительного белка необходим белок MobC (Scherzinger E., et al., 1992). MobC помогает в раскрытии цепи, распространении области разделения цепей ДНК вокруг разрыва, и таким образом он содействует увеличению эффективности разрыва (Zhang S., Meyer R., 1997). Так, например, показано, что плазмида R1162 мобилизовалась с низкой частотой в отсутствии MobC (Zhang S., Meyer R., 1997).

Третий mob - кодируемый белок, MobB, также требуется для эффективной мобилизации. В его присутствии наблюдалось увеличение пропорции молекул плазмиды с разрывом в oriT, он способен стабилизировать релаксому (Perwez T., Meyer, R., 1996). Опубликована модель, в которой MobB участвует в регулировании экспрессии генов R1162, изменяя ее стабильность (Perwez T., Meyer R.J., 1999).

Функция «исключение входа» была предложена для белка MbeD, так как этот белок может связаться через N-концы молекул амфипатических спиралей внутренних мембран (Yamada Y., et al., 1995) Отмечено, что релаксазы pMV158 семейства вовлечены в сайтспецифическую рекомбинацию между сайтами oriT, которая может привести к амплификации генов (Francia M.V., and Clewell D.B., 2002).

Интересно, что пять генов мобилизации, mobA, mobB, mobC, mobD и mobE, принадлежащих pRAS3, pTF-FC2, pTC-F14 и pRA2, оказались эквивалентными генам traI, traJ, traK, traL Trap-коньюгативных систем, соответственно (Ziegelin G., et al., 1991; Rohrer J., Rawlings D.E., 1992).

Сходство не ограничивалось гомологией генов, и касалось порядка и направления их транскрипции (Rohrer J., Rawlings D.E., 1992). Три гена (mobA, mobB и mobC) существенны для мобилизации плазмиды, в то время как другие два (mobD и mobE) только увеличивали частоту мобилизации.

Достаточно много известно о mob области плазмиды RP4. Эта плазмида, возможно, является наиболее изученной из всех коньюгативных плазмид. Она является типичным представителем релаксаз семейства 3H-ColE1 (Zechner E.L., et al., 2000; Lanka E., Wilkins B.M., 1995). Белок TraI является релаксазой, в то время как TraJ и TraK - два ДНК- связывающих белка-помощника, которые, как полагают, помогают TraI получать доступ к сайту связывания через различные процессы, такие, как изменение локальной структуры ДНК и изменения суперскрученности ДНК. До сих пор функции TraL и TraK неизвестны (Zechner E.L., et al., 2000).

Интенсивный сайт-направленный мутагенез использовался для обнаружения каталитических аминокислотных остатков.

Обнаружено, что каталитический центр релаксомы реализуется через три Мотива белка MobA (рис. 6) (Francia M.F., 2003). Сравнительный анализ последовательностей аминокислотных остатков, составляющих три Мотива каталитического центра релаксомы и белка MobA pAH 36-4 CPA показал, что ген mobA плазмиды pAH 36-4 CPA детерминирует все три каталитических домена релаксазы (рис.6). Анализ аминокислотной последовательности Мотивов I, II, III позволяет отнести релаксазу pAH36-4CPA к семейству ColEи подсемейству MOBHEN.

Релаксазы ColE1 семейства обладают каталитическим тирозином (Tyr - № 19) в Мотиве I, каталитическим серином (Ser - № 55, 59) и дополнительно остатком глицина (Gly - № 56, 68) в Мотиве II, а также каталитическим гистидином (His - № 97) в Мотиве III.

Сравнение последовательности MobA, детерминируемых геном mobA pAH 36-4CPA позволяют сделать вывод о том, что замены нуклеотидов, последовательности mobA плазмиды pAH 36-4CPA, приводящие к заменам аминокислотных остатков MobA, не затрагивают каталитические аминокислотные остатки релаксирующего комплекса.

Мотив I 5 10 15 pAH36-4 CPA M I V K F H P R G R G G G A G P V D Y L L G Семейство ColE1 M I V K F H - - - R G G G A G P V D Y L L G Консенсус I M I V K F H R G G G A G P V D Y L L G Мотив II 50 55 60 65 pAH36-4 CPA Y V K K Y T S G V L S F A E A D L P P G Q R Семейство ColE1 F A K K Y T S G V L S F A E K E L P P G G R Консенсус II K K Y T S G V L S F A E L P P G R Мотив III 90 95 100 105 pAH36-4 CPA Q Y S I L W V E H A D K G R L E L N F L I P N T E Семейство ColE1 Q Y S I L W V E H Q D K G R L E L N F V I P N M E Консенсус III Q Y S I L W V E H D K G R L E L N F I P N E Рис. 6. Сравнительный анализ усредненных последовательностей релаксаз семейства ColE1 (Мотив I, Мотив II и Мотив III) и последовательности MobA, детерминируемый плазмидой pAH 36-4CPA.

Условные обозначения: A - Аланин, D - Аспарагиновая кислота, G - Глицин, E - Глутаминовая кислота, F – Фенилаланин, H - Гистидин, I - Изолейцин, K - Лизин, L - Лейцин, N – Аспарагин, M- Метионин, P - Пролин, Q – Глутамин, R - Аргинин, S - Серин, T - Треонин, Y - Тирозин, W – Триптофан, V - Валин.

Исследование процесса трансфера плазмиды pAH 36-4CPA C. hydrophila IBRB-36 4CPA Исследование функционирования генов mob pAH 36-4CPA C. hydrophila IBRB-36 4CPA проводили с использованием нескольких генетических маркеров, позволяющих тестировать трансфер плазмиды. В роли одного из маркеров были использованы детерминанты деградации хлорфеноксиуксусных кислот (tfd), которые, как было показано ранее, находятся под контролем плазмиды pAH 364CPA. В качестве дополнительных маркеров были специально подобраны маркеры устойчивости к антибиотикам и солям тяжелых металлов. Поиск дополнительных маркеров осуществляли следующим образом. Плазмида pAH 36-4CPA была элиминирована из клеток штамма C. hydrophila IBRB-36-4CPA, а затем бесплазмидные варианты клеток были протестированы в сравнении с клетками, обладающими плазмидами, на селективных средах. В качестве тестируемых признаков были взяты реакции к действию нескольких антибиотиков (стрептомицина, эритромицина, олеандомицина) и ионов некоторых тяжелых металлов (Cu2+, Cd2+, Zn2+, Pb2+, Mn2+, Sn2+, Cr2+) (табл. 4).

Как видно из данных табл. 4, присутствие в клетках C. hydrophila IBRB36-4CPA плазмиды pAH 36-4CPA обеспечило их устойчивость к стрептомицину. Вместе с тем, удаление плазмиды pAH 36-4CPA из клеток C.

hydrophila IBRB-36 4CPA не влияло на их отношение к эритромицину и олеандомицину, что указало на хромосомную природу этих генов.

Результаты тестирования устойчивости клеток к ионам тяжелых металлов показали, что на плазмиде pAH 36-4CPA расположены детерминанты устойчивости к иону цинка Zn2+, в то время как гены устойчивости к ионам Pb2+, Mn2+, Sn2+ и Cr2+ располагаются на хромосоме.

Таблица Локализация детерминант устойчивости к антибиотикам и ионов тяжелых металлов C. hydrophila IBRB-36 4CPA Оценки воздействия на клетки C. hydrophila IBRB-36 4CPA Селективный агент Генотип pl+ pl– Стрептомицин (str) + - Антибиотики Эритромицин (ery) + + Олеандомицин (ole) + + Zn2+ (цинк) + - Ионы Pb2+ (свинец) + + тяжелых Mn2+ (марганец) + + металлов Sn2+ (олово) + + Cr2+ (хром) + + Условные обозначения: + - устойчив, - - чувствителен.

В ходе дальнейшей работы была проверена возможность переноса плазмиды pAH 36-4CPA в клетки новых хозяев, а именно, бактерий Gluconobacter oxydans IBRB-2T и Raoultella planticola IBRB-33 4CPA. С этой целью клетки штамма-донора плазмиды pAH 36-4CPA, содержащих гены str, zinc и tfd C. hydrophila IBRB-36 4CPA и штаммов-реципиентов Gluconobacter oxydans IBRB-2T, несущих гены kan, amp, cob и cad и Raoultella planticola IBRB-33 4CPA, обладающих генами cat, mob и fer культивировались в богатой среде. В результате были получены трансконъюганты, обладающие признаками устойчивости к антибиотикам и ионам тяжелых металлов, детерминируемыми плазмидой pAH 36-4CPA. Результаты исследования представлены в табл. 5.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»