WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Экстракция и электрофорез ДНК Эксперименты по исследованию фрагментации ДНК проводили в совместной работе с Н.В. Лобышевой (НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова). ДНК выделяли из нижнего эпидермиса 10-дневных проростков гороха сорта Альфа. Навеска эпидермиса для выделения ДНК составляла 25 – 35 мг. После инкубации с реагентами, образцы растирали в ступке с жидким азотом и суспендировали в лизирующем буферном растворе (0,05 М Трис-НСl, pH 7,4, 0,025 М ЭДТА, 1%-ный додецилсульфат натрия) при комнатной температуре. Гомогенаты дважды депротеинизировали встряхиванием с фенолом. Нуклеиновые кислоты из отделенной центрифугированием водной фазы осаждали добавлением 1 объема изопропанола. После растворения осадка в ТЕ-буфере (0,05 М Трис-НСl, рН 7,5, 0,005 М ЭДТА) к смеси добавляли раствор РНКазы А (Sigma, США) в концентрации 100 мкг/мл и смесь инкубировали 20 мин при 37°. После повторной фенольной депротеинизации ДНК осаждали добавлением изопропанола и осадок растворяли в ТЕ-буфере. Электрофорез препаратов ДНК проводили в течение 1,5 ч при 4–5 В/см в 1%-ном агарозном геле в 0,М Трис-ацетатном буфере, pH 8,0, содержащем бромистый этидий (0,5 мкг/мл).

Результаты и их обсуждение Н2О2 подавляет фотосинтетический перенос электронов и вызывает гибель клеток цианобактерии A. variabilis Рисунок 2, а иллюстрирует фотоиндуцированный сигнал ЭПР с g-фактором 2,0026, обусловленный окислением Р700, первичного донора электрона ФСI в клетках A. variabilis. В ответ на освещение устанавливается стационарный уровень Р700+. В темноте происходит восстановление Р700+, и сигнал ЭПР исчезает с полувременем (t1/2) мс (табл. 1). Н2О2 увеличивал амплитуду сигнала ЭПР и замедлял его послесветовую релаксацию (рис. 2, б и табл. 1). CN– снижал амплитуду сигнала Р700+, но не влиял на скорость его темнового затухания (рис. 2, в и табл. 1). Этот результат свидетельствует об ингибирующем действии Н2О2 на восстановление компонентов электрондонорной ветви ФСI.

Таблица 1. Амплитуда сигнала ЭПР реакционных центров Р700 и время t1/их послесветового восстановления в клетках A. variabilis до и после обработки EDTA Добавки Концентрация, Амплитуда Время t1/мМ сигнала ЭПР, % темновой релаксации сигнала ЭПР, мс До обработки EDTA Контроль – 100 H2O2 25 120 NaCN 1 70 EDTA 10 100 H2O2 + NaCN 100 + 1 120 H2O2 + NaCN + EDTA 100 + 1 + 10 110 После обработки EDTA Контроль – 100 H2O2 25 100 NaCN 1 70 H2O2 + NaCN + EDTA 100 + 1 + 10 100 Увеличение времени послесветовой релаксации сигнала ЭПР реакционных центров ФСI, по-видимому, связано с экстракцией марганца из кислородвыделяющего комплекса (КВК) и ингибированием фотосинтетического транспорта электронов на уровне ФСII.

Ионы Mn2+ в водных растворах характеризуются шестиполосным спектром ЭПР. Сигнал ЭПР исчезал в присутствии комплексообразователя EDTA и снижался при добавлении CN–: связанный Mn не дает характеристического спектра ЭПР.

Несвязанный (или, возможно, непрочно связанный) Mn2+ содержится в отмытых клетках A. variabilis (рис. 3, а) и составлял 20% общего марганца клеток. Добавление HCl к суспензии клеток приводило к значительному увеличению сигнала ЭПР в результате высвобождения связанного марганца и его восстановления до Mn2+ (рис. 3, а, в).

Содержание свободного Mn2+ в клетках возрастало до 25% при добавлении H2O2 в концентрации 40 мМ (рис. 3, б) и даже до 30% общего марганца при добавлении H2O2 в концентрации 200 мМ и значительно снижалось при обработке клеток EDTA (рис. 3, г). Высвобождение марганца из КВК при воздействии H2O2 приводило к окислительному повреждению реакционных центров ФСII, так как КВК не мог эффективно восстанавливать P680+ (Самуилов и др., 2004, Hakala et al., 2005).

Таблица 2. Индуцированное Н2О2 разрушение фикоцианина (D630–720 нм), хлорофилла а (D680–720 нм) и уменьшение светорассеяния (D720 нм) суспензий клеток A. variabilis. Клетки инкубировали в темноте с Н2О2 в течение 20 ч Н2О2, мМ D630–720 нм D680–720 нм D720 нм 0 0,18 0,17 0,1 0,11 0,12 0,10 0,08 0,12 0,100 0,03 0,08 0,Темновая инкубация клеток с H2O2 и CN– (добавленного для ингибирования H2O2разлагающих гемовых ферментов – каталазы и пероксидаз) в течение 2 ч не оказывала влияния на спектры поглощения. Увеличение срока инкубации с Н2О2 до 20 часов приводило к прогрессирующему с увеличением концентрации H2O2 снижению оптической плотности фикобилинов и в меньшей степени хлорофилла а, а также к уменьшению светорассеяния клеточных суспензий (табл. 2). Значительному разрушению подвергался фикоцианин (табл. 2), нейтрализующий радикалы НО•, НО2•, О2., а также пероксинитрит (см. Bhat and Madyastha, 2001 и литературу, цитированную там).

Таким образом, Н2О2 вызывал экстракцию марганца из интактных клеток цианобактерий, подавлял активность КВК и фотосинтетический перенос электронов, приводил к разрушению фотосинтетического аппарата и гибели клеток A. variabilis.

Состояние клеток A. variabilis при солевой обработке и инкубации с Н2О2 и менадионом Ранее показано, что внутриклеточное образование Н2О2 в присутствии менадиона (витамина К3), также как и добавленный Н2О2 в концентрациях 0,1–10 мМ, ингибируют рост цианобактерий (Самуилов и др., 1999). Добавление 100 мМ NaCl вызывает гибель A. variabilis по механизму апоптоза: в клетках увеличивается активность протеаз, происходит фрагментация ДНК, цитоплазма вакуолизируется, на терминальной стадии клетки подвергаются автолизу (Ning et al., 2002).

Клетки A. variabilis инкубировали с 0,5 М NaCl, 10 мМ Н2О2 и 0,1 мМ менадиона.

Изучение при помощи световой микроскопии в контроле, без добавок, показало, что A. variabilis образует длинные нити вегетативных клеток. Флуоресцентная микроскопия с окраской при помощи DAPI показала, что ДНК нуклеоидов флуоресцирует в виде гранул преимущественно в центре клеток. Флуоресценция хлорофилла наблюдалась во всех клетках. Трихомы укорачивались при инкубации с 0,5 М NaCl в течение 20 часов.

Флуоресценция DAPI-ДНК в клетках снижалась, в некоторых исчезала полностью (рис. 4, а). Обработка менадионом вызывала исчезновение флуоресценции нуклеоидов, связанной с DAPI у части клеток, при добавлении пероксида водорода нуклеоиды разрушались почти во всей популяции A. variabilis (рис. 4, а и б). Флуоресценция хлорофилла при этом сохранялась (рис. 4). Сходные данные в отношении показателя преломления в центре клетки цианобактерии были получены с использованием когерентной фазовой микроскопии клеток A. variabilis, обработанных 0,5 М NaCl, 10 мМ Н2О2 и 0,1 мМ менадиона.

Ингибирующее действие солевой (Allakhverdiev et al., 2002) и окислительной (Nishiyama et al., 2005) обработки связывают с подавлением синтеза белка D1 ФСII на уровне транскрипции и трансляции. Добавление менадиона вызывает внутриклеточную генерацию Н2О2. Менадион способен образовывать О2· и Н2О2, восстанавливаясь ФС II, b6f-цитохромным комплексом и ФС I хлоропластов и окисляясь кислородом.

Действие Н2О2 на CN–-индуцированное разрушение ядер устьичных и эпидермальных клеток из эпидермиса листьев гороха Ранее было показано, что CN– является эффективным индуктором ПКС у растений и вызывает разрушение ядер УК и ЭК (Самуилов и др., 2000). Пероксид водорода усиливал CN–-индуцированное разрушение ядер в устьичных клетках листьев гороха в концентрациях 10–100 мкМ. Стимулирующее действие Н2О2 на разрушение ядер ЭК, обработанных 2,5 мМ KCN, было ниже, чем на УК, проявлялось при более высоких концентрациях Н2О2 (100 мкМ и выше) и на некоторых препаратах эпидермиса отсутствовало.

Рис. 5 иллюстрирует данные оптической (а) и флуоресцентной (окраска DAPI) микроскопии (б, в, г) клеток в пленках эпидермиса. DAPI – проникающий в клетки флуоресцирующий краситель, который связывается с обогащенными тимином и аденином участками в малых бороздках двунитевой ДНК (см. Trotta et al., 2003 и литературу, цитированную там). Морфология ядер ЭК значительно менялась уже через 30 мин инкубации с CN– и Н2О2 (рис. 5, б, II и в, II): происходили их вздутие и деформация, разделение на доли, вызванные фрагментацией ДНК. Спустя 2,5 ч инкубации с CN– и Н2О2 ядра ЭК исчезали (рис. 5, а, б, III). Структурные изменения ядер УК происходили позднее. Образование многолопастных структур в ядрах УК, их фрагментация наблюдались через 8 ч инкубации с CN– и Н2О2 (рис. 5, г, II). CN–-Индуцированное разрушение ядер УК зависит от активных форм кислорода (АФК) (Samuilov et al., 2003).

Межнуклеосомная фрагментация ДНК при обработке CN– и CN– + Н2ООдним из признаков апоптоза эукариот является распад ДНК на фрагменты, кратные размеру нуклеосомы – 180-200 пар оснований (Wyllie, 1980). Образование таких фрагментов хорошо регистрируется методом электрофореза. На рис. 6 представлены электрофореграммы препаратов ДНК, выделенных из нижнего эпидермиса листьев 10дневных проростков гороха. Обработка пленок эпидермиса 2,5 мМ CN– в течение 15 и мин не вызывала фрагментации ДНК (рис. 6, а). В контроле (без добавок) ДНК не образовывала расщепленных фрагментов. При обработке 2,5 мМ CN– характерная для апоптоза «лестница» наблюдалась через 3 ч инкубации, при этом значительная часть ДНК находится в высокомолекулярной форме (рис. 6, б). Через 6 ч инкубации эпидермальных пленок с CN– межнуклеосомный распад ДНК продолжался, уменьшалось количество высокомолекулярной ДНК. При обработке эпидермиса комбинацией CN– и Н2Онаблюдалось усиление распада ДНК на фрагменты (рис. 6, в). Так, фрагментация ДНК начиналась уже через 30 мин инкубации с CN– + Н2О2. Интенсивность фрагментации ДНК увеличивалась со временем инкубации. Через 3 и 6 часов инкубации доля фрагментированной низкомолекулярной ДНК была заметно выше при обработке CN– + Н2О2, чем при обработке одним CN– (рис. 6, в).

Влияние ингибиторов электронтранспортных цепей на CN–-индуцированное разрушение ядер эпидермальных клеток CN–-Индуцированный апоптоз УК предотвращался DCMU, ингибитором транспорта электронов между первичным (QA) и вторичным (QB) пластохинонами в ФСII хлоропластов, и DNP-INT, ингибитором окисления пластохинола на участке o b6fцитохромного комплекса хлоропластов (Самуилов и др., 2002, Samuilov et al., 2003). Их действие на УК снималось или резко снижалось при обработке эпидермиса комбинацией CN– + Н2О2 (рис. 7). Возможно, между УК и ЭК существует взаимодействие на уровне активных форм кислорода и сигнал о гибели передается от УК к ЭК. Для проверки этого предположения изучено действие DCMU и DNP-INT на CN–-индуцированное разрушение ядер ЭК. Сами по себе DCMU и DNP-INT не вызывали разрушения ядер ЭК (рис. 7), CN– вызывал почти 100%-ное разрушение ядер ЭК. Свет, DCMU и DNP-INT лишь незначительно влияли на этот процесс, что не подтверждает взаимодействия УК и ЭК в апоптозном разрушении ядер ЭК.

Действие хинакрина на CN–-индуцированное разрушение ядер ЭК Было испытано действие хинакрина, ингибитора NAD(P)H-оксидазы плазматической мембраны (Van Gestelen et al., 1997, Papadakis and Roubelakis-Angelakis, 1999, Frahry and Schopfer, 2001, Dat et al., 2003). Хинакрин в концентрациях до 100 мкМ не влиял на дыхание митохондрий и фотосинтетическое выделение O2 хлоропластами в нарезках листьев, но предотвращал CN–-индуцированное разрушение ядер УК в плёнках эпидермиса листьев (Самуилов и др., 2006). Хинакрин сам по себе не вызывал разрушения ядер ЭК и не влиял на CN–-индуцированное разрушение ядер ЭК (рис. 8).

Гибель УК и ЭК в пленках эпидермиса гороха зависит от наличия АФК и предотвращается антиоксидантами или в анаэробных условиях (Самуилов и др., 2002, Samuilov et al., 2003). Хинакрин ингибировал Н2О2-зависимое окисление нефлуоресцирущего DCFH до флуоресцирующего DCF в ответ на добавление Н2О2 или менадиона (Самуилов и др., 2006).

Таким образом, NAD(P)H-оксидаза плазматической мембраны, вероятный источник активных форм кислорода при программируемой гибели устьичных клеток в эпидермисе листьев гороха (Самуилов и др., 2006), по-видимому, не участвует в CN–-индуцированном разрушении ядер ЭК.

Выводы 1. Предложена экспериментальная модель изучения программируемой клеточной гибели на цианобактерии A. variabilis в условиях солевой и окислительной обработки.

2. Н2О2 оказывал деструктивное воздействие на цианобактерию A. variabilis, вызывал распад фикобилинов и хлорофилла а. Инкубация клеток с пероксидом водорода вызывала повреждение ФСII, экстракцию Mn2+ из кислородвыделяющего комплекса, подавляла фотосинтез.

3. Солевая (NaCl) и окислительная (Н2О2, менадион) обработка A. variabilis приводили к гибели клеток с признаками программируемой смерти – разрушением нуклеоидов и фотосинтетического аппарата. Разрушение наследственного аппарата является универсальным звеном при ПКС у бактерий и эукариот.

4. Н2О2 значительно усиливал CN–-индуцированную гибель устьичных клеток в эпидермисе, изолированном из листьев гороха и, в меньшей степени, гибель эпидермальных клеток.

5. Ингибиторы переноса электронов в фотосинтетической электронтранспортной цепи хлоропластов DCMU и DNP-INT эффективно предотвращали CN–-индуцированную программируемую смерть устьичных клеток из листьев гороха на свету и лишь незначительно влияли на ПКС эпидермальных клеток, вызванную CN–. Это указывает на отсутствие взаимосвязи устьичных и эпидермальных клеток на уровне активных форм кислорода.

6. Хинакрин, ингибитор NADPH-оксидазы плазматической мембраны, предотвращал CN–-индуцированную программируемую смерть устьичных клеток, что может свидетельствовать об участии NADPH-оксидазы как источника АФК в их гибели. Однако хинакрин не влиял на CN–-индуцированную гибель эпидермальных клеток.

7. Таким образом, признаки программируемой клеточной смерти обнаруживаются как у растений, так и цианобактерий. Разрушение нуклеоида у бактерий и ядра у клеток эукариот, а также нарушение функции ФСII служат, по-видимому, свидетельством того, что первыми универсальными мишенями при ПКС являются энергообеспечение и наследственный аппарат клетки.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Самуилов В.Д., Тимофеев К.Н., Синицын С.В., Безряднов Д.В. (2004) Н2О2Индуцируемое ингибирование фотосинтетического выделения О2 клетками Anabaena variabilis. Биохимия, 69, 926-33.

2. Синицын С.В., Несов А.В., Безряднов Д.В., Тимофеев К.Н., Федоренко Т.А., Самуилов В.Д. H2O2-Индуцированное ингибирование фотосинтетического выделения О2 клетками Anabaena variabilis. III съезд биофизиков России, 24-29 июня 2004 г., Воронеж, 2004, с. 456-457.

3. Киселевский Д.Б., Синицын С.В., Федоренко Т.А., Самуилов В.Д.

Мембранные Н2О2-каналы Материалы VIII Молодежной конференции ботаников, Санкт-Петербург, 17-21 мая 2004 г., с. 126-127.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»