WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Исследование формирования ишемического очага с помощью метода МРТ и окраски ТТС с анализом моторного дефицита в передних конечностях крыс В ходе эксперимента животных разделили на 2 группы: ИШ – крысы, перенесшие перекрытие СМА (n=8); ЛО – ложнооперированные животные (n=7). Результаты исследования зоны ишемического повреждения, вызванного перекрытием среднемозговой артерии нитью, с помощью МРТ и окраски 2,3,5-трифенилтетразолия хлоридом показали, что в данной модели ишемии кора, включая сенсомоторную область, и стриатум являются основными областями повреждения. При исследовании головного мозга крыс через сутки после ишемии зона поражения определялась с помощью МРТ как повышение сигнала (гиперинтенсивность) на Т2-взвешенных изображениях по отношению к интактному белому веществу за счет развития цитотоксического отека. По результатам морфометрического анализа МР-изображений на 1-е сутки объем пораженного полушария головного мозга был на 143% больше не пораженного вследствие отека, вызванного ишемией. На 7-е сутки после инициации ишемии объем пораженного полушария существенно уменьшился и был на 31,2% больше объема контралатерального полушария, по данным МРТ прослеживалось снижение степени гиперинтенсивности зоны поражения по сравнению с первыми сутками после ишемии. При учете степени отека поврежденной зоны истинные размеры пораженной области на 1-е и на 7-е сутки как по данным МРТ, так и ТТС метода были довольно близки по абсолютным значениям (таблица). В группе ложнооперированных животных при МРТ исследовании и ТТС методом повреждения не были обнаружены. По данным МРТ на первые сутки объем повреждения от всего полушария составил 553,3%, а на 7-е сутки 59,33,3%. Эти данные указывают на то, что в используемой нами модели основной процесс формирования ишемического очага происходит в течение первых суток после ишемии.

Количественные данные объемов очагов и их локализация, полностью коррелировали с сенсомоторными нарушениями конечностей этих животных, оцененных с помощью поведенческих тестов. В тесте «Цилиндр» перед индукцией ишемии независимое использование контра- и ипсилатеральной передней лапы было 19% и 13% соответственно от всех касаний стенки цилиндра. На 7-й день после операции у крыс с ишемией использование поврежденной лапы (контралатеральной поврежденному полушарию головного мозга) статистически значимо снижалось в 2 раза (до 10%). Это снижение компенсировалось повышением использования ипсилатеральной лапы в 4 раза, что по сравнению с ЛО группой составляло 53% (P<0,05). Следует отметить, что через суток после ишемии наблюдалась не полная, но статистически значимая компенсация неврологического дефицита в тесте «Стимулирования конечностей» с 4+0,9 до 5,4+1,(P<0,05) баллов по сравнению с 4 сутками. Параллельно с развитием изменения неврологического дефицита у крыс с ишемией наблюдалось устойчивое снижение массы тела, которое было максимальным (183,6% от массы до операции) на 4-й день и регрессировало к 7-м суткам (9,33,3%). В группе ЛО снижение массы тела наблюдалось только в первые два дня после операции и было незначительным.

Таблица. Объемы поражения коры и стриатума при фокальной ишемии головного мозга крыс с учетом степени отека пораженной зоны.

Размер поражения в зонах Размер поражения в зонах Время после ишемии мозга в мм3 (метод МРТ) мозга в мм3 (ТТС- метод) кора стриатум кора стриатум Сутки после ишемии 192+28 57+3,7 - - 7 суток после ишемии 199+29 47+5,3 217+25 57+6,Исследование динамики формирования ишемического очага методом МРТ Для исследования динамики формирования очага ишемического повреждения крысам (n=6) перекрывали нитью СМА и через 30 и 60 мин проводили МРТ-исследование.

Далее животное доставали из томографа и восстанавливали кровоток, извлекая нить.

После реперфузии МРТ-исследование проводилось через 1, 2, 3, 5 ч, а также на 1-е и 7е сутки.

А И ш е м и я Р е п е р ф у з и я И ш е м и я Р е п е р ф у з и я 1 ч 5 ч 7 сут 1 ч 5 ч 7 сут 1 ч 1 ч Б И ш е м и я Р е п е р ф у з и я И ш е м и я Р е п е р ф у з и я 1 ч 5 ч 7 сут 1 ч 5 ч 7 сут 1 ч 1 ч Рис. 1. Динамика формирования фокального ишемического очага. На рисунке представлены МР-изображения трех одинаковых срезов репрезентативного мозга, сделанных для разных областей мозга. А – диффузионно-взвешенное изображение; Б – Т2 взвешенное изображение.

Анализ диффузионно-взвешенных МР-изображений выявил наличие областей с гиперинтенсивным сигналом в области стриатума и коры уже через 30 мин ишемии. Через 60 мин ишемии сигнал становился более четким. После начала реперфузии гиперинтенсивность сигнала резко увеличивалась, и ее максимум приходился на 3-5 часов (рис 1А). Данная динамика изменения гиперинтесивности сигнала свидетельствует об активно происходящих в это время патологических процессах связанных с цитотоксическим отеком клеток. К 7-м суткам интенсивность сигнала снижалась, местами на МР-изображениях были области с гипоинтенсивным сигналом в стриатуме и в коре.

Расположение этих областей совпало с расположением кистозных трансформаций, выявленных с использованием режима подавления сигнала воды.

Анализ Т2-взвешенных изображений, полученных во время ишемии, не выявил изменения сигнала через 30 и 60 мин. Изменение интенсивности сигнала происходило только через час после начала реперфузии, что, по-видимому, связано с первичным повреждением эндотелия капилляров. Далее гиперинтенсивность сигнала повышалась и достигала максимума к 1-м суткам. На 7-е сутки Т2-взвешенные изображения были гетерогенными, имелись области как с гиперинтенсивным сигналом (с повышенным содержанием жидкости), так и с гипоинтенсивным сигналом (рис. 1Б). Морфометрический анализ Т2-взвешенных изображений выявил динамику формирования ишемического очага (рис. 2). Из графика видно, что максимальный объем зоны повреждения ишемического очага приходился на 1-е сутки, а к 7-м суткам он немного снижался, что связанно с уменьшением отека ткани. Таким образом, видно, что образование ишемического очага является динамическим процессом. Во временном промежутке с 1 до 3 ч после реперфузии формирование очага происходило на 55% по сравнению с 1-ми сутками, а с 3-5ч зона поражения возрастала еще на 16%. Полученные нами результаты указывают на наличие в нашей модели обширной зоны пенумбры, за счет которой идет увеличение объема инфаркта.

Также, во время изучения динамики формирования ишемического повреждения через 5 часов после начала реперфузии изучали нарушения проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). Первоначально получали Т1-взвешенные изображения, где области инфаркта соответствовал гипоинтенсивный сигнал. Далее крысам внутривенно вводили контраст – гадолиний. Гадолиний является парамагнитном металлом, который уменьшает времена релаксации Т1 и Т2 протонов и таким образом усиливает сигнал на Т1-взвешенных изображениях. В норме гадолиний не проходит через гематоэнцефалический барьер, поэтому он проникает в головной мозг только в тех местах, где барьер нарушен. На Т1-взвешеных контраст-усиленных изображениях через 5 мин после введения контраста в области стриатума и коры сигнал становился более гиперинтенсивным у всех животных (рис. 3). Через 20 мин происходило еще большее накопление контраста в области повреждения. Полученные нами результаты хорошо А А 1,1,1,1,0,0,Б Б 0,0,0,30мин 60мин 1ч 2ч 3ч 5ч 1сут 7сут Ишемия Реперфузия Рис. 2. Динамика изменения объема ишемического повреждения, измеренного на Т2взвешенных изображениях. Объемы нормированы В В на 5 ч точку.

согласуются с литературными данными, что через 5 ч реперфузии происходит нарушение ГЭБ (NeumannHaefelin et al., 2000).

Рис. 3. Нарушение ГЭБ через Таким образом, нами была отработана фокальная модель ч после реперфузии на Т1взвешенных изображениях ишемии головного мозга с воспроизводимой локализацией и (Т1ВИ). А – Т1ВИ до введения объемом ишемического повреждения. Изучена динамика контраста; Б – Т1ВИ через 5 мин после введения контраста; В - формирования объема инфаркта. Показаны функциональные Т1ВИ через 20 мин после последствия ишемического повреждения бассейна СМА, что введения контраста. Пунктирным овалом отмечена ишемическая выражалось в асимметрии использования передних область (гипоинтенсивный конечностей в тесте «Цилиндр» и падение балла сигнал). Сплошным овалом отмечена ишемическая область с неврологического статуса в тесте «Стимулирование нарушением ГЭБ (гиперконечностей». Можно заключить, что выбранная нами интенсивный сигнал).

модель соответствует требованиям, предъявляемым к моделям ишемии головного мозга для изучения нейропротекторных препаратов.

Исследование нейропротекторной активности ионов лития Во второй части работы мы изучали возможность фармакологической коррекции нарушений, вызванных ишемией головного мозга, с помощью фармакологических воздействий препаратами, имеющими различные механизмы действия. Первая задача, которая перед нами стояла – протестировать нашу экспериментальную модель перекрытия СМА на возможность коррекции ишемического повреждения препаратом с известными нейропротекторными свойствами и сравнить полученные результаты с данными других исследований. В качестве такого вещества нами был выбран хлорид лития LiCl, так как механизм его антиапоптотического действия был достаточно хорошо изучен для патологий ЦНС (Rowe and Chuang, 2004).

Нами исследовалась нейропротекторная активность LiCl в дозе 3 ммоль/кг при внутрибрюшинном введении сразу после начала реперфузии. По результатам морфометрического анализа ТТС-изображений размер ишемического очага у животных, которым инъецировали только физиологический раствор, был равен 28629,5 мм3 (n=5).

При лечении LiCl наблюдалось достоверное уменьшение очага повреждения, в этом случае его объем был 14022 мм3 (n=6). По усредненным данным объем очага уменьшался на 51% (P<0,01).

Количественные данные, указывающие на уменьшение объема очага у животных, которым инъецировали LiCl, полностью коррелировали с данными неврологического статуса, оцененного в тесте «Стимулирование конечностей». Для крыс, получавших LiCl, неврологический дефицит был в 4 раза ниже по сравнению с группой, которой инъецировали только физиологический раствор, и составлял 6 баллов (P<0,01) на 1-е сутки после операции.

Полученные нами результаты полностью совпадают с данными Рен и соавторов, использовавших идентичную модель и концентрацию препарата, где уменьшение объема ишемического очага составило 50%, а также отмечалось значительное снижение неврологического дефицита (Ren et al., 2003). Таким образом, полученные нами результаты указывают на возможность коррекции последствий ишемии головного мозга наряду с нормализацией функционального состояния ЦНС в постишемическом периоде, а также подтверждают данные о нейропротекторном действии ионов лития.

Исследование нейропротекторной активности пептида PGP В данном разделе нашей работы было проведено исследование нейропротекторных свойств пептида PGP в дозе 0,1 и 0,5 мг/кг, который вводили в/б через 1 ч после начала реперфузии, а далее на 1 и 2 сутки после операции. Выбор препарата сделан на основании его высокой нейропротекторной активности, показанной раннее in vitro (Сафарова, 2003).

Поведенческие тесты проводили за сутки до индукции ишемии. На 4-й день после индукции ишемии животные были исследованы при помощи теста «Стимулирования конечностей», а на 7-й день тестами «Стимулирования конечностей», «Цилиндр» и «Сужающаяся дорожка». На 7-е сутки после операции животных декапитировали и срезы мозга окрашивали ТТС.

Проведенный подробный морфометрический анализ ишемического повреждения в коре и стриатуме по ТТС-изображениям показал, что в контрольной группе, которой инъецировали в/б только физиологический раствор, объем инфаркта в коре был равен 115,235,5 мм3 (n=6). При лечении пептидом в дозе 0,1 мг/кг наблюдалось значительное уменьшение объема инфаркта в коре, который составил 62,540 мм3 (n=10), что соответствует по усредненным данным снижению очага инфаркта на 45% по сравнению с контролем. В группе животных, которым инъецировали 0,5 мг/кг PGP, очаг был равен 11343 мм3 (n=9). Различий по объему инфаркта в стриатуме между группами выявлено не было, объем ишемического повреждения для всех групп составил в среднем 422,5 мм3.

Тест «Стимулирования конечностей» выявил снижение неврологического дефицита на 4-е и 7-е сутки после ишемии у животных, получавших PGP. Однако на 4-й день восстановление было незначительным, и повышение составило 1 и 1,5 балла для групп, леченных дозой пептида 0,1 и 0,5 мг/кг, соответственно, по сравнению с контролем. На 7-й день тенденция была более выраженной, леченые крысы имели по 6,7 и 7,4 баллов для доз 0,1 и 0,5 мг/кг, соответственно, тогда как не леченая группа набрала только 5,3 балла.

Сходная картина была получена на 7-й день после операции в тесте «Сужающаяся дорожка». В данном тесте оценивался сенсомоторный и моторно-координационный дефицит для поврежденной передней и задней конечностей одновременно. Данные представляли как процентное соотношение количества соскальзываний для каждой конечности от общего числа шагов. Для задней конечности процент соскальзывания уменьшался на 18,6% и 23% для животных получавших PGP в дозе 0,1 и 0,5 мг/кг, соответственно, по сравнению с группой, получавшей физиологический раствор. Для передней конечности было отмечено снижение процента соскальзывания на 33% только у животных, леченых PGP в дозе 0,1 мг/кг, по сравнению с контрольной группой.

В тесте «Цилиндр» за 1 сутки до индукции ишемии независимое использование левой передней лапы или одновременно с правой лапой, было одинаково и составляло в среднем 51,53,7% для всех групп животных. На 7-й день после операции у крыс всех групп, использование поврежденной левой лапы (является контралатеральной поврежденному полушарию головного мозга) снижалось. Это снижение было гораздо менее выражено у крыс, которым после ишемии в течение трех дней вводили PGP. У этих животных использование левой лапы увеличивалось в 2 раза в обеих группах независимо от дозы PGP по сравнению с группой, получавшей физиологический раствор, и составило 24,53,5%.

Во всех поведенческих тестах данные, полученные для ложнооперированных животных не имели статистически значимых отличий от данных, полученных за 1 сутки до операции.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»