WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

На основании полученных данных можно сделать вывод, что рекомбинантный токсин имеет не только пространственную организацию аналогичную организации природного «слабого» токсина, но и обладает молекулярно-динамическими свойствами природного токсина.

Рис. 11. (А). Анализ вторичной структуры рекомбинантного и природного WTX с помощью КДспектроскопии. Пунктирной линией изображен спектр природного WTX, точечной линией изображен спектр ренатурированного рекомбинантного WTX, точечно-пунктирной линией изображен спектр рекомбинантного WTX c восстановленными дисульфидными связями. (Б), (В), Н ЯМР спектры природного и рекомбинантного WTX, соответственно.

12. Исследование биологической активности «слабого» токсина Исследования биологической активности, описываемые в этом разделе, были проведены совместно с И.Е. Кашеверовым, ведущим научным сотрудником лаборатории рецепции нейропептидов ИБХ РАН. Способность рекомбинантного токсина специфически взаимодействовать с мышечным нАХР и нейрональным 7нАХР была оценена по конкуренции с I-меченным -бунгаротоксином за связывание с мембранами из электрического органа Torpedo californica и клетками GH4C1, трансфецированными 7нАХР человека, соответственно (Рис. 12). В качестве сравнения использовали природный «слабый» токсин, выделенный из яда N. kaouthia. Анализ кривых ингибирования позволил определить значения IC50 для рекомбинантного «слабого» токсина и природного «слабого» токсина на мышечном рецепторе (рис.6А, IC50 4.3±0.3 мкМ и 3.0±0.5 мкМ, соответственно) и нейрональном 7нАХР (рис.6Б, IC50 31±5 мкМ и 14.8±1.3 мкМ, соответственно).

Активность рекомбинантного продукта оказалась несколько меньшей, чем у природного токсина, что возможно обусловлено наличием на N-конце молекулы рекомбинантного токсина дополнительного остатка метионина.

Рис. 12. Кривые конкурентного ингибирования связывания 125I--бунгаротоксина с мембранами из электрического органа Torpedo californica, содержащими мышечный нАХР (А), и линией клеток GH4C1 содержащими 7нАХР человека (Б), построенные для рекомбинантного и природного «слабого» токсина.

13. Конструирование и исследование биологической активности мутантных вариантов «слабого» токсина С целью исследования влияния основных структурных особенностей «слабого» токсина на функциональную активность с помощью сайт-направленного мутагенеза было сконструировано 11 мутантных вариантов WTX (Рис. 13). Основная структурная особенность «необычных» токсинов и в частности WTX, отличающая их от других -нейротоксинов, – наличие дополнительной, пятой дисульфидной связи, расположенной в N-концевой петле молекулы. C целью исследовать функциональную значимость наличия дисульфидной связи в N-концевой петле Рис. 13. Сравнение аминокислотных последовательностей «слабого» токсина, его мутантных форм и кандоксина (Bungarus сandidus). Введенные мутации выделены красным цветом. Желтым цветом обозначены остатки Cys.

WTX был сконструирован мутант С6S/C11S, в котором остатки Cys в N-концевой петле были заменены на остатки Ser. Ранее для коротких и длинных нейротоксинов было показано, что аминокислотные остатки, ответственные за взаимодействие с рецептором, расположены на конце центральной петли. Было выдвинуто предположение, что остаток Trp36, расположенный на конце центральной петли WTX, может играть важную роль при взаимодействии с нАХР.

Для проверки функциональной значимости этого остатка был сконструирован мутант W36A. Для исследования значимости заряженных аминокислотных остатков Arg31 и Arg32, также расположенных в центральной петле, были сконструированы следующие мутантные формы: R31A, R32A, R31A/R32A, R31A/R32E, R31E/R32A.

Известно, что «слабый» токсин в растворе обладает конформационной гетерогенностью вследствие cis-trans изомерии пептидных связей Xxx-Pro. Для выяснения влияния этого свойства «слабого» токсина на биологическую активность были получены мутанты P7A, P33A и P7A/P33A. «Необычные» токсины, как правило, обладают слабой афинностью по отношению к нАХР мышечного типа.

Однако для «необычного» токсина кандоксина из яда Bungarus сandidus значение IC50 для нАХР из Torpedo californica cоставляет 50 нМ, что сопоставимо со значениями констант ингибирования, определяемых для коротких и длинных нейротоксинов. По аналогии с короткими и длинными -нейротоксинами было выдвинуто предположение, что остатки, расположенные на конце центральной петли кандоксина, ответственны за высокое сродство токсина к рецептору. Для проверки этого предположения, был получен химерный токсин, в котором участок центральной петли «слабого» токсина (Q30-W36) был заменен на аналогичный фрагмент кандоксина (REARGT). Предполагалось, что в случае истинности этого предположения мутант Q30RRPLSW36/REARGT будет обладать повышенным сродством к нАХР из Torpedo californica.

Способность мутантов «слабого» токсина специфически взаимодействовать с мышечным и нейрональным 7нАХР была оценена по конкуренции с 125I-меченным -бунгаротоксином за связывание с мембранами из электрического органа Torpedo californica и клетками GH4C1, трансфецированными 7нАХР человека, соответственно (Табл. 1.). Анализ активности полученных мутантов выявил, что: 1) наличие дополнительной дисульфидной связи в первой петле снижает сродство WTX к обоим типам рецептора; 2) конформационная гетерогенность WTX не оказывает значительного влияния на активность токсина; 3) остаток Trp36, находящийся на конце центральной петли токсина, важен только для взаимодействия с мышечным нАХР; 4) замена положительно заряженных остатков Arg в положениях 31 и 32 на нейтральные или отрицательно заряженные остатки негативно сказывается на активности «слабого» токсина по отношению к обоим типам рецептора, при этом одновременная замена обоих остатков Arg приводит к селективному исчезновению активности WTX по отношению к 7нАХР. Замена Мутанты IC50 мкМ IC50 мкМ Таблица. 1. Значения IC50, «слабого» Torpedo -7нАХР характеризующие взаимодействие токсина californica «слабого» токсина и его мутантов с Дикий тип 5.1+0.2 52+мышечным и нейрональным нАХР, оцененные по конкуренции с С6S/C11S 1.8+0.1 18+I-меченным -бунгаротоксином.

Q30RRPLSW36/ 23.0+0.2 200+REARGT W36A 16.0+1.0 49+P7A 7.9+0.3 30+P33A 7.3+0.6 48+P7A/P33A 5.8+0.1 30+R31A 15.1+0.1 66+R32A 14.4+0.3 89+R31A/R32A 19.4+0.3 >>R31E/R32A 19.4+0.6 >>R31A/R32E 15.8+0.2 >> фрагмента центральной петли WTX на фрагмент центральной петли кандоксина также приводит к значительному уменьшению активности химерного токсина.

Вероятно, за высокое сродство кандоксина с рецептором отвечают другие остатки.

14. ЯМР анализ влияния точечных мутаций «слабого» токсина на конформационную гетерогенность Анализ спектров ЯМР 15N-меченого аналога «слабого» токсина показал, что степень введения метки составляет не менее 97%. Полученный двумерный Н-15N-HSQC спектр этого препарата (Рис. 14) подтвердил наличие двух конформационных состояний в молекуле WTX. Методами ЯМР спектроскопии, используя 3D спектры 1 Н-15N-NOESY-HSQC и Н-15N-TOCSY-HSQC, было получено практически полное отнесение сигналов токсина в воде при pH 5.5 (Рис. 14). Наибольшие различия химических сдвигов сигналов HN групп основной цепи между двумя формами пептида наблюдались для остатков, сближенных с остатками Pro7 и Pro33, в последовательности токсина. Анализ 2D 1Н-NOESY спектров «слабого» токсина 1 Рис. 14. Н-15N-HSQC-спектр ЯМР N-меченого «слабого» токсина (pH 5.5, 40°C). Сигналы формы токсина соответствующей trans-конфигурации пептидной связи Arg32-Pro33 показаны красным цветом. Сигналы cis-формы обозначены звездочками и показаны синим цветом. Сигналы HN и H2N групп боковых цепей обозначены знаком “s”. Сигнал HN1 боковой цепи Trp36 обведен.

Сигналы HN групп основной цепи, для которых наблюдаются наибольшие различия в химических сдвигах между двумя формами пептида, соединены зелеными стрелками.

подтвердил, что наблюдаемая конформационная гетерогенность WTX обусловлена cis-trans изомерией пептидной связи Arg32-Pro33.

Рис. 15. Фрагменты 1D H-ЯМР спектров природного «слабого» токсина, рекомбинантного «слабого» токсина и его мутантных форм. Показана область с сигналами HN1 боковой цепи Trp36. Показано содержание конформационной формы токсина, соответствующей trans-конфигурации пептидной связи Ххх32-Pro33. Названия мутантных форм «слабого» токсина, не демонстрирующих конформационной гетерогенности, подчеркнуты. В качестве контроля показан фрагмент спектра мутанта с заменой Trp36/Ala.

Для изучения влияния точечных мутаций на процессы конформационного обмена в молекуле WTX были проанализированы 1D H-ЯМР спектры мутантных форм токсина. Для оценки относительного содержания различных конформеров токсина в растворе, использовали сигналы протона HN1 боковой цепи Trp36, который демонстрировал разные химические сдвиги в двух конформациях WTX, содержащих пептидную связь Arg32-Pro33 в cis- и trans-конфигурации (Рис. 15).

Несмотря на меньшую полуширину сигнала HN1 Trp36 в trans-конформере, интегральная интенсивность обоих сигналов была примерно одинакова, что указывало на приблизительно одинаковое содержание обеих конформационных форм. Как и ожидалось, при введении замены Pro33/Ala, сигнал, соответствующий cis-конфигурации пептидной связи Arg32-Pro33, переставал детектироваться в спектрах ЯМР. Размыкание дисульфидной связи в первой петле токсина путем введения двойной замены Cys6/Ser и Cys11/Ser или введение мутации Pro7/Ala вело к изменению заселенностей конформеров (рис. 15). При этом содержание формы токсина, имеющей trans-конфигурацию пептидной связи Arg32-Pro33, возрастало до 60 и 65%, соответственно. Видимо, изменения в конформации первого петлевого участка токсина влияют на конформацию второй петли, содержащей остатки Proи Trp36, что, возможно, указывает на пространственную сближенность фрагментов первой и второй петель токсина. Заметное увеличение заселенности transконформационной формы токсина (до 75%) также наблюдалось при введении замены Arg32/Ala. При этом, введение в положение 31 остатка Ala, равно как и замена Arg32/Glu не приводили к перераспределению заселенностей. Полученные результаты указывают на важность заряженного остатка в 32 положении (Arg или Glu) для стабилизации cis-конфигурации пептидной связи Ххх32-Pro33.

Выводы 1. Получены гены химерных длинных -нейротоксинов, созданных на основе нейротоксина II из яда Naja oxiana (NTII), путем введения в центральную петлю NTII дополнительных аминокислотных остатков, а также гены «слабого» токсина из яда Naja kaouthia (WTX), относящегося к классу «необычных» токсинов, и его мутантных вариантов. Разработанные эффективные схемы биосинтеза, выделения и очистки позволили наработать рекомбинантные нейротоксины, их мутантные и изотопно-меченные варианты в необходимых для исследования количествах.

2. Показано, что химерные -нейротоксины, полученные на основе NTII, приобрели способность взаимодействовать с нАХР 7 типа, что подтвердило ключевую роль центральной петли длинных -нейротоксинов в селективном взаимодействии с этим рецептором. Показано, что замена Ala/Lys в центральной петле длинных -нейротоксинов не приводит к возникновению активности по отношению к нАХР 32 типа.

3. Исследована биологическая активность рекомбинантного WTX и его мутантных вариантов по отношению к мышечному нАХР и нейрональному нАХР 7 типа.

Показано, что:

- удаление дополнительной дисульфидной связи в N-концевой петле WTX увеличивает его сродство к рецепторам обоих типов;

- остаток Trp36 важен только для взаимодействия с нАХР мышечного типа;

- cis-trans изомерия пептидной связи Arg32-Pro33 в молекуле WTX, как и наличие остатка Pro7, не оказывает значительного влияния на биологическую активность токсина;

- заряженные остатки Arg31 и Arg32 центральной петли токсина важны для взаимодействия с нАХР мышечного и нейронального 7 типа, при этом замена обоих остатков аргинина приводит к селективной потере активности по отношению к нейрональному нАХР 7 типа.

4. Методами спектроскопии ЯМР проведено полное отнесение сигналов в ЯМР спектрах 15N-меченого аналога WTX. Изучено влияние точечных мутаций WTX на конформационную гетерогенность токсина, обусловленную cis-trans изомерией пептидной связи Arg32-Pro33.

Основные научные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Dmitry Lesovoy, Eduard Bocharov, Ekaterina Lyukmanova, Yurij Kosinsky, Mikhail Shulepko, Dmitry Dolgikh, Mikhail Kirpichnikov, Roman Efremov, and Alexander Arseniev. Specific membrane binding of neurotoxin II can facilitate its delivery to acetylcholine receptor. Biophys. J., 2009, 97, 2089-2097.

2. Е.Н. Люкманова, М.А. Шулепко, Р.В. Тихонов, З.О. Шенкарев, А.Н. Вульфсон, И.Е. Кашеверов, Т.Л. Устич, Ю.Н. Уткин, А.С. Арсеньев, В.И. Цетлин, Д.А.

Долгих, М.П. Кирпичников. Бактериальная продукция и ренатурация из телец включения «слабого» токсина, белка с высоким содержанием дисульфидных связей. Биохимия, 2009, 74(10), 1142-1149.

3. Е.Н. Люкманова, М.А. Шулепко, И.Е. Кашеверов, З.О. Шенкарев, К.С. Минаев, А.С. Парамонов, А.С. Арсеньев, Д.А. Долгих, В.И. Цетлин, М.П. Кирпичников.

Структурно-функциональные исследования механизмов молекулярного действия эндогенных нейромодуляторов никотинового ацетилхолинового рецептора.

Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю.А.

Овчинникова. Москва-Пущино. 2009, 130.

4. E.N. Lyukmanova, M.A. Shulepko, Z.O. Shenkarev, I. Kasheverov, Yu.N. Utkin, V.I.

Tsetlin, D.A. Dolgikh, M.P. Kirpichnikov. Structure-functional investigation of ‘weak’ toxin from Naja kaouthia: bacterial production, refolding, mutagenesis and NMR study.

J. Neurochem. 2009, 110(suppl.1), 81.

5. М.А. Shulepko, E.N. Lyukmanova, Z.O. Shenkarev, D.A. Dolgikh, M.P. Kirpichnikov.

Effective bacterial expression of three-finger neurotoxins from snake venom. FEBS J.

2008, 275(suppl.1), 412.

6. Е.Н. Люкманова, З.О. Шенкарев, М.А. Шулепко, Г.С. Копеина, И.Е. Кашеверов, Д.М. Лесовой, Э.В. Бочаров, Ю. Косинский, В.И. Цетлин, Д.А. Долгих, А.С.

Арсеньев, М.П. Кирпичников, Нейротоксины яда змей и никотиновый ацетилхолиновый рецептор: исследование лиганд-рецепторных взаимодействий.

XX Зимняя международная молодежная научная школа “Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии”. Москва. 2008, 21.

7. E.N. Lyukmanova, M.A. Shoulepko, D.A. Dolgikh, M.P. Kirpichnikov. Bacterial Expression of Disulfide-Rich Snake Neurotoxins. Essential Protein Enginering Summit.

Boston, USA. 2008, 219.

8. Ekaterina N. Lyukmanova, Zakhar O. Shenkarev, Alexey A. Schulga, Yaroslav S.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»