WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Сравнение одномерного 1Н ЯМР спектра химерного токсина NTII/I[А29K] с HSQC спектром токсина NTII/I (Рис. 5В) показало, что точечная мутация A29K не приводит к изменению пространственной структуры химерного токсина. Таким образом, можно сделать вывод, что все исследуемые белки обладали жесткой пространственной структурой, схожей со структурой нейротоксина II.

Рис. 5. (А). 1Н-15N HSQC спектр NTII. Сигналы NH групп соотнесены с номером остатка. Сигналы боковых цепей Trp, Asn и Gln помечены буквой S.

(Б). Н-15N HSQC спектр NTII/I. Отнесение сигналов сделано по аналогии с панелью A.

Дополнительные сигналы, возможно соответствующие введенным в центральную петлю остаткам, заключены в кружок. (В). Область амидных сигналов 1D Н ЯМР спектра NTII/I[А29K].

5. Исследование биологической активности химерных токсинов Исследования биологической активности, описываемые в этом разделе, были проведены совместно с сотрудниками лаборатории проф. Д. Бертрана кафедры нейробиологии медицинского факультета Центрального медицинского университета, Женева, Швейцария. Тестирование биологической активности химерных -нейротоксинов NTII/I и NTII/I[А29K] проводили in vitro методами электрофизиологии, измеряя способность белковых препаратов ингибировать токи через ионные каналы нейрональных нАХР 7 и 32 типов, экспрессированных на поверхности ооцитов Xenopus laevis. Было показано, что оба химерных нейротоксина приобрели способность ингибировать нАХР 7 типа. Причем химерный токсин NTII/I оказался несколько активнее природного NTI по отношению к нейрональному нАХР 7 типа (IC50-6.1 нМ и 34 нМ, соответственно, Рис 6А,Б). Таким образом, в отличие от исходного короткого токсина NTII, химерный токсин NTII/I приобрел способность взаимодействовать с нАХР 7 типа, что подтвердило ключевую роль центральной петли длинных -нейротоксинов в селективном взаимодействии с нейрональным нАХР 7 типа.

Многочисленные исследования указывают на то, что удлиненный С-концевой фрагмент длинных -нейротоксинов возможно принимает участие во взаимодействии с нАХР 7 типа. Исследуемые в настоящей работе химерные нейротоксины были получены на основе короткого токсина NTII, не обладающего подобным фрагментом. Однако, наличие высокой активности химерного токсина NTII/I по отношению к нейрональному рецептору говорит о том, что, по крайней мере, для взаимодействия NTI с нАХР 7 типа не требуется наличия удлиненной Сконцевой последовательности.

Предполагалось, что химерный токсин NTII/I[А29K] с заменой Ala/Lys приобретет способность взаимодействовать с нАХР 32 типа. Однако электрофизиологические эксперименты показали, что введение вышеуказанной мутации в молекулу NTII/I не привело к возникновению активности по отношению к нАХР 32 типа. Кроме того, введение мутации Ala/Lys в молекулу NTII/I привело к снижению активности NTII/I[A29K] по отношению к нейрональному нАХР типа (IC50-126 нМ, Рис 6В). Полученные данные свидетельствуют о том, что во взаимодействии -бунгаротоксина с нАХР 32 типа ключевую роль играют другие аминокислотные остатки, локализованные не на конце центральной петли.

Возможно, селективность действия -бунгаротоксина на нАХР 32 типа связана со склонностью этого токсина к димеризации.

Рис. 6. Ингибирование ионных токов, индуцированных добавлением ацетилхолина, в ооцитах Xenopus laevis, экспрессирующих нейрональный нАХР 7 типа препаратами NTI, NTII и химерными токсинами. (А). NTI ингибирует токи с константой IC50-34 нМ, в то время как NTII не вызывает подобного эффекта. (Б). Химерный токсин NTII/I ингибирует токи с константой IC50-6 нМ. (В). Химерный токсин NTII/I[А29K] ингибирует токи с константой IC50-126 нМ.

6. Моделирование комплексов химерных токсинов с нАХР Молекулярное моделирование было выполнено совместно с Д.Ю.

Мордвинцевым, сотрудником лаборатории рецепции нейропептидов ИБХ РАН.

Модели пространственных структур химерных токсинов были построены методом моделирования по гомологии на основе трехмерных структур длинных нейротоксинов NTI и -Cbtx и короткого -нейротоксина NTII (PDB коды 1ntn, 1ctx, 1nor, соответственно). Модели внеклеточных доменов нАХР 7 и 32 типов были построены методом моделирования по гомологии на основе трехмерной структуры ацетилхолин-связывающего белка (АХСБ) из моллюска Lymnaea stagnalis (PDB код 1I9B). В экспериментах по докингу NTII и NTI с 7 и 32 нАХР было установлено, что стабильный комплекс образуется только в случае взаимодействия NTI с 7нАХР. Взаимодействие химерного токсина NTII/I было возможно как с 7нАХР, так и с 32нАХР, но только комплекс 7нАХР/NTII/I был стабилен в течение молекулярно-динамического эксперимента с длиной траектории 10 нс. Основные взаимодействия наблюдались между C-петлей рецептора и центральной петлей NTII/I, также как и в случае комплекса АХСБ/-Cbtx (Bourne et al.,EMBO J., 2005).

При этом между остатком Ala в положении 29 и остатками С-петли нАХР устанавливались слабые гидрофобные взаимодействия. Моделирование связывания NTII/I[А29K] с 7нАХР выявило, что остаток Lys в положении 29 не может участвовать в специфических взаимодействиях с остатками С-петли рецептора и отталкивается от положительно заряженного Lys192 7нАХР (Рис.7). Возможно, этот факт и объясняет уменьшение активности химерного токсина NTII/I[А29K] по отношению к 7нАХР. С другой стороны, результаты молекулярного моделирования позволяют предположить, что Lys29 способен взаимодействовать с отрицательно заряженной боковой цепью остатка Glu190 из 3 субъединицы нАХР 32 типа. Однако комплекс 32нАХР/NTII/I[А29K] был нестабилен в течение молекулярно-динамической траектории (10 нс). Определенные энергии взаимодействия химерного токсина NTII/I[А29K] с нАХР 7 и 32 типов составили 1400 кДж/моль/связывающий сайт и 340 кДж/моль/связывающий сайт, соответственно.

Рис. 7. Модель взаимодействия химерных токсинов с 7 нАХР. Часть, относящаяся к молекуле NTII показана голубым цветом. Часть, относящаяся к молекуле NTI, показана розовым цветом. Одна субъединица нАХР (главная поверхность взаимодействия) показана белым цветом. Вторая субъединица нАХР (комплементарная поверхность взаимодействия) показана бежевым цветом. Показаны боковые цепи остатков NTII/I, NTII/I[А29K] и С-петли главной поверхности нАХР.

II. Структурно-функциональные исследования «слабого» токсина и его мутантных форм 7. Экспрессирующие конструкции для продукции «слабого» токсина Ранее в лаборатории инженерии белка ИБХ РАН были разработаны и успешно применены две системы бактериальной продукции NTII и его изотопно-меченных вариантов. В одной из этих систем нейротоксин нарабатывали в виде слитной полипептидной цепи с тиоредоксином. Между последовательностями нейротоксина и тиоредоксина был предусмотрен специальный линкер, содержащий сайты для специфического гидролиза энтеропептидазой. Вторая система, более успешная с точки зрения конечного выхода целевого белка, была предназначена для бактериальной секреции нейротоксина. Именно эта система позволила получить химерные нейротоксины NTII/I и NTII/I[А29K].

В ходе работы обе системы (Рис. 8А,Б) были опробованы для бактериальной продукции WTX. В первой системе гибридный белок WTX–тиоредоксин накапливался в растворимой форме в цитоплазме. Был подобран протокол очистки гибридного белка с помощью металл-аффинной хроматографии. Однако найти условия специфического гидролиза слитного белка энтеропептидазой не удалось.

Возможно, это связано с тем, что молекула «слабого» токсина содержит дисульфидную связь, образованную третьим и двадцать четвертым остатками цистеина, что, видимо, создает стерические затруднения для работы энтеропептидазы. Использование второй системы, разработанной для бактериальной секреции, оказалось еще менее удачным, так как в этом случае выход целевого белка был ничтожно мал (~ 50 мкг с 1 л бактериальной культуры).

Рис. 8. Схематическое изображение гена WTX в составе различных конструкций для бактериальной продукции «слабого» токсина. (А). Конструкция для продукции «слабого» токсина в виде слитной полипептидной цепи с тиоредоксином. (Б).

Конструкция для секреции «слабого» токсина. В качестве лидерного пептида был использован пептид STII. (В). Конструкция для прямой экспрессии гена «слабого» токсина.

В связи с этим на основе коммерческого вектора рЕТ22b(+) была разработана система для «прямой» экспрессии гена WTX (Рис. 8В), в результате которой рекомбинантный токсин накапливался в цитоплазме бактериальной клетки в виде телец включения. Все мутантные гены WTX были получены методами сайтнаправленного мутагенеза с помощью ПЦР.

8. Биосинтез «слабого» токсина и его мутантных форм Была разработана система продукции «слабого» токсина и его изотопномеченого и мутантных вариантов в штамме BL21(DE3) E. сoli. С целью подбора оптимальных условий продукции WTX были опробованы различные концентрации ИПТГ в диапазоне 0,01–1 мМ и разные сроки культивирования клеток на среде ТВ после индукции (3, 9, 18, 24 и 36 ч). В качестве оптимальных параметров выбраны:

концентрация ИПТГ 0.025 мМ (по достижении культурой плотности клеток, соответствующей значению оптической плотности 1.0 на длине волны 600 нм) и время культивирования клеток после добавления ИПТГ 18 ч. Проведенный с помощью SDS-ПААГ электрофореза анализ показал, что рекомбинантный WTX накапливался исключительно в тельцах включения.

Для продукции N-меченого «слабого» токсина клеточную культуру, предварительно выращенную на среде ТВ в колбах до оптической плотности 1.0 при 600 нм, осаждали в мягких условиях (1000 g). Клеточный осадок стерильно ресуспендировали в 1 л минимальной среды М9, содержащей в качестве источника азота [15N]хлорид аммония («CIL», США). Индукцию и дальнейшее выращивание проводили аналогично культивированию на среде ТВ.

9. Ренатурация «слабого» токсина из телец включения Были опробованы различные подходы ренатурации «слабого» токсина из телец включения. (Рис. 9.) Варьировались следующие параметры: соотношение восстановленного глутатиона (GSH) и окисленного глутатиона (GSSG), рН среды, в которой происходит ренатурация и природа буферного состава среды. Также было исследовано влияние мочевины на ренатурацию токсина. В результате в качестве оптимальной среды для ренатурации был найден буфер следующего состава: 50 мМ Tris/HCl, рН 8.5, содержащий 1.5 М мочевину и смесь GSH/GSSG (3/0,3 мМ).

Конечный выход ренатурированного токсина составил ~5 мг с литра бактериальной культуры.

Рис.9. Ренатурация WTX в различных условиях. Контроль осуществляли с помощью ВЭЖХ.

Хроматографический профиль природного WTX везде обозначен звездочкой. (А). Анализ влияния концентрации GSH/GSSG на эффективность ренатурации WTX в фосфатном буфере, содержащем GSH, GSSG в молярных соотношениях 2:1, 4:1 и 10:1, рН 7.4, при 4°С (хроматографические профили 1-3, соответственно). (Б). Анализ влияния различных значений рН на эффективность ренатурации (хроматографические профили 1-5 соответствуют значениям рН 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, соответственно). (В). Анализ влияния буферного состава среды на ренатурацию (хроматографические профили 1,2 соответствуют буферным системам на основе NaPi и Tris/HCl, соответственно; хроматографический профиль 3 соответствует буферной системе Tris/HCl с добавлением 1.5 М мочевины, 4 - хроматографический профиль рекомбинантного WTX после ренатурации и финальной рехроматографии с помощью ВЭЖХ).

10. Анализ рекомбинантного «слабого» токсина Ренатурированный рекомбинантный «слабый» токсин был проанализирован с помощью масс-спектрометрии (Рис. 10.). Было показано, что экспериментальная масса рекомбинантного WTX (7750 Да) в пределах ошибки измерения совпадает с теоретически расчитанной массой, при этом экспериментальная масса природного токсина, выступавшего в качестве контроля, составила 7619 Да. Разница в значениях масс рекомбинантного и природного токсинов объясняется наличием у рекомбинантного токсина дополнительного остатка метионина на N-конце молекулы. Данные ВЭЖХ, SDS-электрофореза в полиакриламидном геле, а также данные КД- и ЯМР-спектроскопии свидетельствуют о схожих свойствах рекомбинантного и природного WTX. Полное замыкание всех дисульфидных связей в молекуле WTX после ренатурации было подтверждено с помощью реактива Элмана (5,5-дитио-бис(2-нитробензойная кислота).

Рис. 10. Масс-спектрометрический анализ смеси природного и рекомбинантного «слабого» токсина.

Вставка: электрофоретический анализ препаратов природного (1) и рекомбинантного (2) WTX, 3 – белки-маркеры молекулярных масс (116, 66, 45, 35, 25, 18,14 кДа).

11. Анализ пространственной структуры рекомбинантного «слабого» токсина Вторичная структура ренатурированного токсина была исследована методом КД-спектроскопии. Спектр рекомбинантного ренатурированного токсина был идентичен в пределах погрешности спектру природного токсина (рис.11А., точечная и пунктирная линии, соответственно) и указывал на преимущественно структурную организацию молекулы токсина. Полученные оценки содержания различных элементов вторичной структуры рекомбинантного токсина (50% структура, 40% неупорядоченная структура), примерно соответствовали данным, полученным для природного токсина (45% -структура, 50% неупорядоченная структура). При этом анализ вторичной структуры токсина с восстановленными дисульфидными связями показал наличие только неупорядоченной структуры (рис.11А., точечно-пунктирная линия). Вероятно, формирование вторичной структуры «слабого» токсина происходит одновременно с замыканием дисульфидных связей. Возможно, именно это свойство нейротоксинов затрудняет бактериальную продукцию и последующую ренатурацию этих белков.

Качественный анализ пространственной структуры рекомбинантного токсина был проведен также с помощью метода 1Н ЯМР-спектроскопии. Полученный спектр рекомбинантного токсина (Рис. 11Б,В) был практически идентичен спектру природного токсина. Наблюдаемые минорные изменения, возможно, связаны с различиями в протоколах очистки природного и рекомбинантного белков, приводящими к отличиям в солевом составе препаратов. Значительная дисперсия химических сдвигов HN-протонов и сдвиг многих из этих сигналов в область слабого поля подтверждают преимущественно -структурную организацию молекулы токсина. В то же время, расщепление HN сигнала боковой цепи единственного аминокислотного остатка триптофана в 36-ом положении, наблюдаемого в районе 10 м.д., на две линии с соотношением интегральных интенсивностей 1:1 указывает на наличие процесса конформационного обмена в молекуле токсина. Этот обменный процесс, наблюдаемый также и в природном токсине, происходит медленно по шкале времен ЯМР с характерным временем более 100 мс.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»