WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

В основе экспериментального метода поляризации флуоресценции, применяемого в данной работе, лежит последовательное измерение компонент интенсивности флуоресценции с параллельным и перпендикулярным направлениями поляризации. Флуорофорами поглощаются в основном те фотоны, у которых электрические векторы световой волны направлены параллельно диполю поглощения флуорофора при переходе в возбужденное состояние. Для каждого флуорофора диполи поглощения и испускания имеют фиксированную ориентацию, а угол между ними определяет максимальную измеряемую поляризацию флуоресценции Р.

Согласно теории вращательной деполяризации люминесценции Левшина-Перрена, при поляризованном возбуждении справедливо соотношение:

V M 1 1 1 фл = + - вр = = ; ; (2) P P0 P0 3 kT kT вр здесь Р наблюдаемая степень поляризации; Р0 ее предельное значение в отсутствие деполяризации; V, М объем и масса вращающейся молекулы; ее плотность; фл время жизни возбужденного состояния;

вр время корреляции вращательной подвижности (переориентации) молекулы; вязкость раствора.

Степень поляризации убывает с уменьшением времени ориентационной корреляции излучающей молекулы и может служить мерой ее вращательной подвижности. Именно на этой зависимости основан метод поляризации флуоресценции.

Основная часть исследований проводилась на оптической установке с Ar-лазером ILA-120 и фотоэлектрической регистрацией излучения (Рис. 1).

Исследования проводились на длине волны 460 нм (мощность излучения ~ 15 мВт). Спектры флуоресценции снимались на фирменных спектрофлуориметрах «Хитачи» и «Перкин Элмер».

Рис. 1. Схема оптической установки на основе Ar-лазера с изображением хода лучей.

Третья глава посвящена описанию физических свойств, флуоресцентных характеристик исследуемых в работе веществ. В ней содержатся общие сведения о химическом составе и строении исследуемых веществ: макромолекул БСА; тяжелых металлов свинца и кадмия в составе солей Pb(CH3COO)2 и CdSO4; хелата европия соединения Eu3+ с ЭДТА; а также специально подобранных флуоресцентных красителей: DSY, TNS, флуоресцеина.

В четвертой главе содержится экспериментальная часть работы.

Приводятся данные, полученные в результате исследования спектральных характеристик систем растворов, зависимости характеристик макромолекул от различных параметров (концентрации токсичных соединений, концентрации белка, рН среды), проведенные математические расчеты и оценки.

§1 посвящен исследованию спектров и поляризации флуоресценции белковых растворов при добавлении красителя флуоресцеина. Зависимость степени поляризации флуоресценции зонда в водных растворах белка и растворах белка с солью тяжелого металла Cd приведена на Рис.2.

P 0,0,0,-0,05 -0,cFITS, мг/мл 0,0 0,2 0,Рис. 2. Поляризация флуоресценции растворов (рН 7) в зависимости от концентрации флуоресцеина (возб=4579):

1 БСА (СБСА=5,6·10-6М) + флуоресцеин;

2 БСА (СБСА=5,6·10-6М) + CdSO4 (СCd=3,3·10-3М) + флуоресцеин.

В области малых концентраций красителя, где еще не происходит концентрационного тушения, степень поляризации флуоресценции красителя имеет бльшую величину в растворах белка, содержащих ионы кадмия. В соответствии с формулой (2) это свидетельствует о росте времени корреляции вращательной подвижности частиц в этих растворах, а следовательно о росте средней эффективной массы частиц.

§2 четвертой главы посвящен исследованию спектров и поляризации флуоресценции белковых растворов при добавлении флуоресцентного красителя TNS. Было выявлено свойство данного красителя увеличивать квантовый выход флуоресценции при присоединении к поверхности белка.

При добавлении малых концентраций соли Pb2+ в растворы альбумина с красителем, интенсивность флуоресценции красителя увеличивалась с ростом концентрации свинца. Интенсивность флуоресценции красителя в растворах с концентрацией Pb2+, не превышающей ПДК, практически не отличалась от значений интенсивности флуоресценции растворов без тяжелых ионов. Значения степени поляризации частиц в растворах альбумина с Pb2+, как и в случае с Cd2+, были больше значений для альбумина в водном растворе. Что также подтверждает увеличение массы частиц в растворах белка с тяжелыми ионами, связанное с объединением белковых молекул в кластеры.

§3 посвящен исследованию спектров и поляризации флуоресценции белковых растворов при добавлении флуоресцентного красителя DSY.

Интенсивность флуоресценции DSY увеличивалась в растворах белка, содержащих ионы тяжелого металла.

В §4 приведены данные по исследованию флуоресцентных спектров и поляризации флуоресценции растворов БСА при добавлении хелата европия (Eu-ЭДТА). Спектры хелата Eu имеют 3 выраженных максимума, интенсивность флуоресценции в которых зависит от концентрации хелата и рН среды (Рис. 3).

а) б) Рис. 3 а) Спектры флуоресценции растворов хелата Eu, Iотн(исп), возб=460нм:

1 CEu-ЭДТА=232·10-5М; 2 CEu-ЭДТА=116·10-5М; 3 CEu-ЭДТА=15·10-5М; б) рН-зависимости относительной интенсивности флуоресценции Eu-ЭДТА в водных растворах для трех максимумов флуоресцентного спектра (возб=457,9нм):

1 фл=512нм; 2 фл=600нм; 3 фл=622нм.

Оказалось, что добавление альбумина в водный раствор хелата Eu приводит к смещению максимума интенсивности в спектре испускания в более коротковолновую область (Рис. 3). Интенсивность флуоресценции Eu3+ в растворах хелата с альбумином зависит от рН и достигает максимальных значений в области рН 5 (Рис. 5).

Рис. 4. Спектры поглощения раствора хелата европия по сравнению с флуоресцентными спектрами растворов БСА с хелатом европия (рН 7), Iотн(исп), возб=460нм:

1 CEu-ЭДТА=14,5·10-5 М;

2 CBSA=3,3·10-5 М, CEu-ЭДТА=5,7·10-5 М.

Рис. 5. Зависимость интенсивности флуоресценции водных растворов БСА (СБСА=8,3·10М)+хелат Eu (СEu-ЭДТА=4,2·10-6М) от рН среды.

По исследованию поляризации флуоресценции хелата Eu в 60%-х растворах глицерина с белком были найдены значения предельной степени поляризации Р0 (Рис. 6).

а) б) P P 0,0,0,0,0,0,-0,15 -0,сBSA, мг/мл -0,30 -0,30 cBSA, мг/мл 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,Рис. 6. Зависимости степени поляризации флуоресценции частиц в растворах БСА + хелат Eu: а) СEu-ЭДТА=2,9·10-5М; б) СEu-ЭДТА=4,9·10-5М; кривые 1 соответствуют водным растворам; 2 60% растворам глицерина.

§5 посвящен исследованию спектров и поляризации флуоресценции растворов БСА при возбуждении в ультрафиолетовом диапазоне длин волн.

Исследования проводились в водных растворах и 60%-х растворах глицерина, для определения P0. На Рис. 7а приведены зависимости интенсивности флуоресценции альбумина в водных растворах при добавлении ионов металлов тяжелого Pb2+ и легкого Na+.

а) б) Iотн BSA (6,4·10-6M) tвр, нс BSA (6,4·10-6M) + Na+ (5,6·10-3 M) BSA (6,4·10-6M) + Na+ (5,6·10-3M) BSA (6,4·10-6M) + Pb2+(8,3·10-10M) BSA (6,4·10-6M) + Pb2+(8,3·10-10M) BSA (6,4·10-6M) + Pb2+(1,7·10-7 M) BSA (6,4·10-6M) + Pb2+(1,7·10-7M) BSA (6,4·10-6M) + Pb2+(6,3·10-5 M) BSA (6,4·10-6M) + Pb2+(6,3·10-5M) нм, 0 pH 300 350 400 2 3 4 5 6 7 Рис. 7 а) Интенсивность флуоресценции в растворах БСА (рН 7) при добавлении ионов металлов при возбуждении на 270нм; б) Зависимость от рН времени корреляции вращательной подвижности частиц в растворах БСА, содержащих ионы свинца, по сравнению с раствором БСА с ионами натрия.

Эффект уменьшения значения интенсивности при увеличении концентрации Pb2+ (Рис. 7а) можно объяснить изменением энергетических уровней флуоресценции при происходящей агрегации молекул альбумина.

Явление агрегации, или кластеризации, также подтверждают концентрационные зависимости вр(рН) (Рис. 7б). Времена корреляции вращательной подвижности частиц в растворах альбумина при добавлении ионов свинца увеличиваются почти на порядок по сравнению с соответствующим значением вр гидратированного белка в растворе c ионами натрия.

На Рис. 8а приведен расчетный график зависимости отношения масс наночастиц к массе молекулы альбумина от логарифма отношения молярных концентраций белка и ацетата свинца при рН 5.

а) б) M/Mtвр, нс pH pH 5 pH 4,pH 5,M0=66500 Да pH 6,pH pH 3,0 log CPb log CPb/CBSA -10-8-6--4 -3 -2 -1 0 M CPb log M0 CBSA Рис. 8 а) Зависимость от, рассчитанная из параметров флуоресценции водных logCPb в растворах БСА с ацетатом растворов БСА + ацетат Pb; б) Зависимость rot от свинца при разных рН.

M MИз графика (Рис. 8а) видно, что отношение растет при увеличении относительной концентрации свинца в растворах. На Рис. 8б показана зависимость времен корреляции вращательной подвижности частиц в растворах белка с ацетатом свинца от логарифма концентрации свинца для различных значений рН. Наибольшее время корреляции наблюдается при рН 5, т.е. в области изоэлектрической точки белка.

В §6 четвертой главы приведены данные по исследованию растворов сыворотки крови. Оказалось, что флуоресценция сыворотки обусловлена в основном флуоресценцией триптофана: максимумы флуоресцентных спектров наблюдались в области 350 нм. Интенсивность в максимуме спектров зависела от объемного содержания сыворотки в приготовленных растворах. Интегральные значения времен корреляции вращательной подвижности белков, содержащихся в сыворотке крови, для онкологических больных не зависят от рН, что можно объяснить возможной потерей белками транспортной функции при подобных заболеваниях.

Пятая глава посвящена обсуждению полученных экспериментальных результатов (§§1-3), а также обзору экспериментальных данных, полученных независимо с помощью других оптических методов (§4).

В §1 приведен сравнительный обзор экспериментальных данных по исследованию растворов на разных экспериментальных установках:

фирменных спектрофлуориметрах «Хитачи» и «Перкин-Элмер» и на установке с Ar-лазером. Выяснилось, что данные измерений на разных экспериментальных установках хорошо соотносятся между собой и дополняют друг друга.

В §2 проведен сравнительный анализ времен вращательной подвижности и масс частиц в растворах БСА с токсичными ионами по сравнению с теоретически рассчитанными для молекул БСА в водном окружении. В растворах БСА + соль Cd2+ по Рис.2, в соответствии с (2) оценены вр и М частиц. Оказалось, что массы частиц в растворах БСА (СБСА=5,6·10-6М) + CdSO4 (СCd=3,3·10-3М) увеличиваются в 6 раз по сравнению с массами молекул БСА. Массы частиц в растворах БСА + ацетат CPb Pb ( =1,34,9) возрастают в 3 раза по сравнению с массой молекулы CBSA БСА. Массы частиц в растворах БСА (СБСА=7,5·10-79,0·10-6М) + хелат Eu (CEu-ЭДТА=2,9·10-54,9·10-5М) примерно в 8 раз больше, чем масса молекулы БСА.

В §3 проведен расчет сорбции красителя на поверхности альбумина по теории Ленгмюра для некоторых исследованных систем растворов.

§4 содержит экспериментальные зависимости радиусов и масс частиц в растворах БСА+хелат Eu, полученные методами интегрального рассеяния света и корреляционной спектроскопии.

Согласно теории Дебая, для разбавленных растворов макромолекул можно написать следующее вириальное разложение по концентрации c:

dn 2 2 n cHK dc, где величина H определяется формулой:

= (1 + 2BMc +...), H = R90 M 4 N A dn К – фактор Кабана, n0 показатель преломления растворителя, dc инкремент показателя преломления раствора, длина волны возбуждения 2 2 cn (dn dc ) лазера,, П – осмотическое давление раствора. Из этого R = 1 П N 0 A RT c уравнения можно определить массу макромолекулы М и коэффициент межмолекулярного взаимодействия B.

Динамическое рассеяние света связано также как и статическое рассеяние с флуктуациями концентрации рассеивающих частиц. Для растворов макромолекул корреляционная функция G(t), описывающая молекулярное движение, связана с коэффициентом трансляционной kT диффузии Dt: G(t) = G exp(- D k t), k волновой вектор, D =, Rh 0 t t 6R h гидродинамический радиус.

На Рис. 9 показана зависимость массы рассеивающих частиц от рН для раствора БСА, содержащего хелат Eu.

Значения гидродинамических радиусов частиц в растворах БСА при добавлении хелата Eu, полученные с помощью метода корреляции фотонов, возрастают примерно в 2 раза по сравнению с радиусом молекул БСА в воде.

Рис. 9 Зависимость массы рассеивающих частиц от заряда на белке в растворах БСА, содержащих хелат Eu(СБСА = 9,6·10-7М, СEu-ЭДТА = 9,5·10-7М).

Методами светорассеяния и корреляционной спектроскопии подтверждено увеличение средних гидродинамических радиусов частиц в растворах БСА, содержащих комплексон Eu, а также зависимость роста массы наночастиц от рН раствора с максимумом в изоэлектрической точке белка.

В заключении подведены основные итоги диссертационной работы и сформулированы выводы.

ВЫВОДЫ 1. Исследования флуоресценции красителей флуоресцеина, TNS и DSY в растворах БСА с ионами токсичных металлов Pb2+ и Cd2+ показали, что интенсивность флуоресценции в области малых концентраций линейно растет с ростом концентрации тяжелых ионов. Степень поляризации флуоресценции красителей и времена корреляции вращательной подвижности частиц в растворах БСА, содержащих ионы металлов Pb2+ и Cd2+, увеличиваются.

2. Времена корреляции вращательной подвижности и рассчитанные массы частиц в растворах БСА, содержащих ионы Cd2+ и Pb2+, возрастают примерно на порядок по сравнению со временами корреляции вращательной подвижности молекул белка в водном растворе и в растворе, содержащем ионы Na+, что согласуется с данными полученными методом светорассеяния.

3. Обнаружено, что добавление хелата Eu3+ в растворы БСА смещает максимум флуоресцентного спектра в более коротковолновую область, что свидетельствует о взаимодействии молекул хелата с поверхностными группами альбумина.

4. Обнаружено образование наночастиц белковых кластеров в растворах БСА, содержащих хелат европия. Времена корреляции вращательной подвижности в этом случае примерно на порядок больше, чем для молекул альбумина в водном растворе, что также подтверждено с помощью метода светорассеяния.

5. Показано, что предложенная методика позволяет определять ничтожно малые концентрации токсичных ионов в растворах (~10-10М), что возможно использовать для экологического мониторинга.

6. Эффективные (суммарные) времена корреляции вращательной подвижности частиц в растворах сыворотки крови онкологических больных не зависят от рН, что возможно связано с потерей заряда белками в случае онкологических заболеваний.

Результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

Статьи:

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»