WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

УДК 535.37; 532:541.64 Сокол Наталья Васильевна Оптические свойства растворов белков, содержащих ионы тяжелых металлов 03.00.02 – биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 2006

Работа выполнена на кафедре молекулярной физики физического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Научный консультант: доктор физико-математических наук, профессор Петрова Галина Петровна

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор Рууге Энно Куустович кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник Захаров Станислав Дмитриевич

Ведущая организация: Государственное учреждение Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина РАМН

Защита диссертации состоится 8 июня 2006 года в 18:00_ часов на заседании диссертационного совета К 501.001.08 в МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, ГСП-2, г. Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.

Ломоносова, Физический факультет, аудитория _5-19_.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке физического факультета МГУ.

Автореферат разослан _5 мая_ 2006 года.

Ученый секретарь диссертационного совета К 501.001.08, доцент Г.Б. Хомутов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования Большинство метаболических реакций в живом организме осуществляются при непосредственном участии белковых макромолекул. Несомненный интерес для современной биофизики и физико-химической медицины представляют исследования воздействий на белковые системы токсичных металлов, которые являются причиной экологических загрязнений и приводят к серьезным, часто необратимым структурно-функциональным нарушениям в организме.

Токсичные металлы могут находиться в растворах белков как в свободной (ион металла + гидратная оболочка), так и в хелатной формах (ион металла + хелат + гидратная оболочка). Хелатные соединения, в частности этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) с ионами металлов, являются устойчивыми комплексами. Это свойство используется в пищевой промышленности, а также в клинической практике для лечения отравлений тяжелыми металлами. Конкурирующими ионами за место в комплексе с ЭДТА могут выступать ионы кальция, калия, натрия. Поэтому применение комплексов на основе ЭДТА может приводить к нарушениям установившегося равновесия между различными ионами металлов в плазме крови и тканях организма. Молекулы комплексонов практически не подвергаются расщеплению в биологической среде и при определенных концентрациях могут отрицательно воздействовать на слизистую оболочку.

Поведение белковых макромолекул в растворах определяется электростатическим взаимодействием между зарядами на их поверхности.

Однако оказалось, что при определенных условиях, например, когда в растворе присутствуют ионы тяжелых металлов, взаимодействие заряженных групп белковых макромолекул с ними может приводить к экранированию поверхностных зарядов. В этом случае существенную роль начинают играть диполь-дипольные взаимодействия, молекулы белка сближаются на предельно допустимые расстояния, что приводит к изменениям их как статических, так и динамических параметров.

Ранее с помощью методов статического и динамического рассеяния света было показано, что присутствие токсичных ионов в белковых растворах приводит к агрегации частиц и образованию т.н. белковых нанокластеров.

Среди существующих оптических методов флуоресцентные методы анализа являются одними из наиболее чувствительных для определения количественного содержания вещества в биологических образцах.

Параметры флуоресценции чувствительны к структуре окружения флуорофора, поэтому флуоресцентные методы применяются также и для изучения структурных превращений в различных веществах.

Очень важное свойство флуоресцентных методов в биологических экспериментах состоит в том, что измерения люминесценции и спектров поглощения могут проводиться в сильно рассеивающих, гетерогенных средах.

В основе метода поляризации флуоресценции лежит исследование вращательной подвижности молекул в растворах. Вращательная подвижность частиц в растворах белка при добавлении токсичных ионов будет изменяться при образовании белковых структур нанокластеров.

Поэтому, исследуя поляризацию флуоресценции молекул в растворах белка, содержащих токсичные ионы, можно определять времена корреляции вращательной подвижности, которые напрямую связаны с массами и размерами нанокластеров, а также условия их образования в зависимости от параметров среды.

Исследования растворов белков, содержащих ионы тяжелых металлов или их хелатные комплексы, представляют несомненный интерес для понимания механизмов токсического воздействия этих соединений на организм.

Цель и задачи исследования Цель данной работы экспериментальное исследование возникновения макромолекулярных кластеров в растворах альбумина, содержащих ионы тяжелых металлов и хелата европия, с помощью методов поляризации флуоресценции, светорассеяния, флуоресцентной и корреляционной спектроскопии.

Для достижения этой цели в работе предполагалось решить ряд задач:

• создание экспериментальной установки на основе Ar-лазера для изучения поляризации флуоресценции биологических жидкостей в видимом диапазоне длин волн;

• подбор флуоресцентных зондов для исследования вращательной подвижности частиц в растворах альбумина, содержащих ионы тяжелых металлов;

• исследование флуоресценции растворов белков, содержащих соли свинца, натрия и хелат европия;

• получение и сравнение спектров флуоресценции водных растворов альбумина при добавлении токсичных ионов и без них;

• расчет времени корреляции вращательной подвижности и эффективной массы частиц в исследуемых растворах в зависимости от параметров среды (концентрации токсичных ионов, рН);

• сравнение полученных результатов с данными по светорассеянию и корреляционной спектроскопии в тех же системах.

Научная новизна диссертации • С помощью флуоресцентной спектроскопии в видимом и ультрафиолетовом диапазонах длин волн и метода поляризации флуоресценции проведено исследование растворов сывороточного альбумина (БСА) с солями металлов (Na+, Pb2+ и Cd2+) при изменении ряда параметров среды, таких как концентрация макромолекул, рН и ионная сила растворов.

• Впервые с помощью флуоресцентной спектроскопии и метода поляризации флуоресценции проведено исследование растворов хелата европия (соединение ЭДТА с Eu3+) при изменении ряда параметров среды, таких как концентрация и рН растворов.

• С помощью флуоресцентной спектроскопии и метода поляризации флуоресценции проведено исследование растворов БСА, содержащих хелат европия при изменении различных параметров, таких как концентрация компонентов, рН растворов, длина волны возбуждения флуоресценции.

• Показано, что наличие в растворах белка ионов легких металлов (Na+) не приводит к увеличению времени корреляции вращательной подвижности и массы частиц. Наличие в растворах БСА ионов тяжелых металлов (Cd2+, Pb2+) вызывает образование наночастиц белковых кластеров.

• Впервые показано, что наличие в растворах БСА молекул хелата европия приводит к образованию белковых макромолекулярных комплексов наночастиц, как и при добавлении солей тяжелых металлов.

• Показано, что значения времен корреляции вращательной подвижности частиц в растворах белков, содержащих тяжелые ионы, растут при увеличении ионной силы (концентрации).

• Получены зависимости времен корреляции вращательной подвижности частиц в белковых растворах от поверхностного заряда на макромолекулах; эти зависимости имеют максимумы в изоэлектрической точке белка.

• Метод поляризации флуоресценции применен для исследования растворов сыворотки крови; показано, что интегральные характеристики времен корреляции вращательной подвижности белков сыворотки крови могут различаться для здоровых людей и пациентов с онкологическими заболеваниями.

Научно-практическая значимость исследования Основные результаты работы способствуют развитию представлений о молекулярно-динамических процессах, происходящих в растворах белковых макромолекул, содержащих ионы легких и тяжелых металлов, а также вносят вклад в понимание природы межмолекулярных взаимодействий.

Изученное в работе поведение белковых макромолекул в растворах и их взаимодействие с ионами различных металлов, в том числе с ионами тяжелых металлов, может быть использовано в исследованиях изменений физико-химических характеристик сыворотки крови, происходящих при патогенезе многих распространенных заболеваний.

Метод поляризации флуоресценции, отличающийся высокой чувствительностью и специфичностью, возможно применять для диагностики заболеваний (в том числе онкологических) на ранних стадиях их развития, даже при незначительных изменениях свойств сыворотки крови.

Материалы диссертации могут быть использованы при разработке физических методов мониторинга загрязнения природных сред тяжелыми металлами, а также для создания диагностических приборов.

Защищаемые положения • Показана возможность определения малых концентраций ионов токсичных металлов в свободной и хелатной формах с помощью флуоресцентных методов.

• С помощью метода поляризации флуоресценции обнаружено образование наночастиц белковых кластеров в водных растворах альбумина в присутствии ионов тяжелых металлов свинца и кадмия.

• Обнаружено, что присутствие молекул хелата европия в растворах БСА приводит к увеличению времени корреляции вращательной подвижности частиц, что, по-видимому, связано с образованием белковых кластеров.

• Независимо методами интегрального светорассеяния и фотоннокорреляционной спектроскопии подтверждено образование наночастиц в растворах альбумина, содержащих ионы хелата европия.

Апробация работы Основные результаты диссертационной работы были представлены на конференциях: International Conference ALT-03 (Silsoe, 2003), Четвертая Всероссийская научная конференция «Физические проблемы экологии» (Москва, 2004), Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов 2004», «Ломоносов 2005» (Москва, 2004, 2005), II Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии (Москва, 2005), International Conference ICONO/LAT 2005 (St. Petersburg, 2005), Конференция молодых ученых в рамках всемирного дня физики в МГУ, (Москва, 2005), ежегодная научная конференция «Ломоносовские Чтения» 2006 (Москва, 2006), Photonic West, Diagnostics and Sensing VI (San-Jose, USA, 2006).

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 05-02-17838 и Университеты России 01.03.077.

Публикации По материалам диссертационной работы имеется 13 публикаций, в числе которых 3 статьи в российских и международных научных журналах.

Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения и списка литературы, содержащего 90 наименований. Объем работы составляет 173 страницы, включая 98 рисунков и 18 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении представлена общая характеристика диссертационной работы.

Обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, изложены научная новизна и практическая ценность полученных результатов.

Первая глава диссертации посвящена описанию взаимодействий в растворах электролитов. В §1 изложены основные положения теории ДебаяХюккеля, описывающей поведение полиэлектролитов в растворе в свете простейшей модели твердых сфер, погруженных в сплошную среду и взаимодействующих по закону Кулона. Согласно этой теории, каждая молекула оказывается окруженной атмосферой противоионов, что приводит к частичной экранировке кулоновских взаимодействий. Даны определения ионной силы, коэффициента активности ионов, рН среды и изоэлектрической точки.

В §2 изложена теория взаимодействия в растворах электролитов.

Описаны виды слабых взаимодействий между молекулами растворов.

В §3 описан механизм взаимодействия ионов металлов с заряженными макромолекулами в растворах, приведен обзор экспериментальных работ по исследованию растворов белков с ионами тяжелых металлов. Белки в растворе представляют собой полиэлектролиты, основным видом взаимодействия между которыми является кулоновское отталкивание. Ионы тяжелых металлов будут взаимодействовать с противоположно заряженными группами на поверхности белка, нейтрализуя тем самым суммарный поверхностный заряд макромолекул. В этом случае характер взаимодействия белковых макромолекул будет определяться конкуренцией сил диполь-дипольного притяжения и сил кулоновского отталкивания.

Согласно Скэтчарду, свободная энергия межмолекулярного взаимодействия в таких растворах определяется вторым вириальным коэффициентом B:

2 V1 Z 22 23cB = + -, (1) M 4c3 2 4 + 233cздесь V1 удельный объем растворителя; M2 масса макроиона, cконцентрация ионов соли; Z суммарный заряд на белковой поверхности.

Параметры ij характеризуют эффект исключенного объема и взаимодействие между парами ионов (индекс 2 относится к макромолекулам белка, 3 – ионам соли). Очевидно, что коэффициент взаимодействия меняется с ростом суммарного заряда на белке по параболическому закону (эффект Доннана) с минимумом в изоэлектрической точке.

Таким образом, если эффективный поверхностный заряд Z0, что наблюдается в области изоэлектрической точки, то белковые макромолекулы могут сблизиться на предельно малые расстояния. Это значит, что создаются такие условия (при минимуме свободной энергии), что молекулам выгоднее объединиться в комплексы кластеры.

Вторая глава посвящена описанию методов люминесцентного анализа. Рассмотрены физические основы явления флуоресценции и основные законы флуоресценции (§1). Описан экспериментальный метод поляризации флуоресценции (§2), а также экспериментальные установки (§3) и методика проведения эксперимента (§4).

Свечение атомов, молекул, ионов и других, более сложных соединений, возникающее в результате испускания фотонов из электронновозбужденных состояний в этих частицах, называется люминесценцией.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»