WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Влияние акцепторов электронов на H2O2-зависимое образование DCF. Менадион, восстанавливаясь фотосистемой II, b6f-цитохромным комплексом и фотосистемой I хлоропластов, а также митохондриальными NADH: и сукцинат: убихинон-оксидоредуктазой и bc1-цитохромным комплексом, окисляется О2 с образованием О2· и Н2О2. Рост выхода флуоресценции DCF в пленках эпидермиса из листьев гороха, индуцированный менадионом, усиливался при последующем добавлении Н2О2 и подавлялся НСТ, окисляющим О2· с образованием формазана и тем самым предотвращающим образование Н2О2 (рис. 2, линии 1, 2). Акцепторы электронов N,N,N,N-тетраметил-п-фенилендиамин (ТМФД), 2,6-дихлорфенолиндофенол (ДФИФ), а также п-бензохинон (БХ) не вызывали образование флуоресцирующего красителя (рис. 2, линии 3, 4). Эти соединения, взаимодействующие с ФСII, b6f-цитохромным комплексом и ФСI хлоропластов, подавляют фотовосстановление NADP+. Они подавляют также восстановление убихинона в митохондриях, взаимодействуя с NADH: убихинон-оксидоредуктазой, сукцинат: убихинон-оксидоредуктазой и bc1– цитохромным комплексом дыхательной цепи. Восстановленные формы этих соединений не взаимодействуют с кислородом, не вызывают образование О2· и Н2О2, необходимого для окисления DCFH. Напротив, аскорбат, добавленный вслед за ТМФД, образует электрондонорную пару для ФСI, генерирующей Н2О2 с участием супероксиддисмутазы.

Рис. 2. Влияние различных агентов на флуоресценцию DCF в пленках эпидермиса из листьев гороха. Добавки: 100 мкМ менадиона, 100 мкМ Н2О2, 200 мкМ НСТ, 100 мкМ ТМФД, 100 мкМ ДФИФ, 5 мМ аскорбата.

Действие антиоксидантов на H2O2-зависимую флуоресценцию DCF.

Антиоксиданты NAC и тролокс (водорастворимое производное -токоферола) подавляли и предотвращали менадион-индуцированное образование DCF в пленках эпидермиса из листьев гороха (рис. 3). Они подавляли также CN– –индуцированное разрушение ядер устьичных и эпидермальных клеток (рис. 4).

Рис. 3. Влияние антиоксидантов на флуоресценцию DCF, индуцированную менадионом. Добавки: 100 мкМ менадиона, 5 мМ NAC, 100 мкМ тролокса, 10 нМ MitoQ, мкМ Н2О2.

Рис. 4. Влияние NAC и тролокса на CN––индуцированное разрушение ядер в клетках эпидермиса из листьев гороха. Пленки эпидермиса после инфильтрирации с NAC или тролоксом преинкубировали 15 мин, затем добавляли KCN, вновь проводили инфильтрацию.

Разрушение ядер устьичных клеток регистрировали через 20 ч инкубации пленок эпидермиса в темноте или на свету. Разрушение эпидермальных клеток регистрировали через 1 ч инкубации в темноте. Добавки: 2,5 мМ KCN, 5 мM NAC, 100 мкМ тролокса.

Испытано действие производного убихинона 2,3-диметокси-пбензохинонилдецилтрифенилфосфония (MitoQ) на ПКС у растений. MitoQ представляет собой убихинон, ковалентно связанный с децилтрифенилфосфонием. Этот проникающий катион избирательно, по градиенту мембранного потенциала, накапливается в митохондриях.

На клетках животных показано, что MitoQ реагирует с дыхательной цепью митохондрий, проявляет свойства антиоксиданта и защищает клетки от гибели, вызванной Н2О2.

Восстанавливаясь дыхательной цепью, MitoQ избирательно блокирует окислительное повреждение митохондрий (Кelso et al., 2001). MitoQ подавлял и предотвращал образование DCF, вызванное менадионом, но не Н2О2 (рис. 3).

Влияние ингибитора флавиновых ферментов хинакрина на Н2О2-зависимую флуоресценцию DCF. В зависимости от концентрации АФК в клетках происходит активация или ингибирование различных ферментов. Хинакрин в испытанных концентрациях не оказывал влияние на дыхание и фотосинтетическое выделение О2 (Самуилов и др., 2006), но подавлял рост флуоресценции, вызванный менадионом и Н2О2. Добавленная каталаза, не проникающая в клетки, подавляла и предотвращала рост флуоресценции DCF, вызванный добавленным Н2О2 (рис. 5). Эти результаты позволяют предположить, что NADPH-оксидаза плазматической мембраны, чувствительная к хинакрину (Van Gestelen et al., 1997), генерирующая О2· и активирующаяся при действии менадиона и Н2О2, может быть ответственна за рост флуоресценции DCF. На клетках животных известен эффект АФКиндуцированного образования АФК (Zorov et al., 2005).

Рис. 5. Влияние хинакрина на флуоресценцию DCF в пленках эпидермиса из листьев гороха. Добавки: 100 мкМ Н2О2, 2 ед. активности/мл каталазы, 50 мкМ хинакрина.

Влияние генераторов синглетного кислорода на Н2О2-зависимую флуоресценцию DCF. Гербициды диурон (3,4-дихлорофенил)-1,1-диметилмочевина) и бромоксинил (3,5дибром-4-гидроксибензонитрил), ингибирующие перенос электронов в ФСII, вызывали образование DCF в клетках, устойчивое к добавке каталазы, но чувствительное к НСТ (рис.

6). Диурон и бромоксинил индуцируют образованием триплетного хлорофилла в результате рекомбинации зарядов между восстановленным феофитином и реакционным центром Р680, это ведет к образованию 1О2 (Rutherford et al., 2001). БР и TMRE, фотосенсибилизирующие генерацию синглетного кислорода, предотвращали распад ядер УК, вызванный СN-. БР на свету сам по себе не усиливал флуоресценцию DCF (рис. 7 линия 1). Последующая добавка NADH вызывала рост выхода флуоресценции DCF (рис. 7, линия 1), что свидетельствует, повидимому, о функционировании апопластной пероксидазы. НСТ подавлял увеличение флуоресценции DCF в ответ на добавку NADH. В отсутствие БР NADH не влиял на флуоресценцию DCF и на менадион-индуцированный рост его флуоресценции (рис. 7, линии 2, 3).

Ядра устьичных клеток окрашиваются PI при инкубации эпидермиса с БР на свету (данные не представлены). Доля флуоресцирующих ядер в темноте была значительно ниже, чем на свету, и не отличалась от контрольной величины (без добавок). В присутствии KCN, индуктора апоптоза, происходил распад ядер, и флуоресцирующие фрагменты ДНК давали свечение объема, ограниченного клеточной стенкой. Распад клеточных ядер, вызываемый CN–, на свету предотвращался БР.

Рис. 6. Влияние диурона (DCMU) и бромоксинила на флуоресценцию DCF в клетках эпидермиса из листьев гороха. Добавки: 10 мкМ DCMU, 200 мкМ НСТ, 2 ед. активности/мл каталазы, 100 мкМ бромоксинила.

Рис. 7. Влияние БР на флуоресценцию DCF в клетках эпидермиса из листьев гороха.

Добавки: 20 мкМ БР, 10 мМ NADH, 200 мкМ НСТ, 100 мкМ менадиона.

Оксиметрические данные показывают, что преинкубация насечек листьев гороха с БР в течение 1 ч значительно снижала скорость фотосинтетического выделения О2 (рис. 8). Это может быть связано с тем, что 1О2, генерируемый БР, вызывает расщепление белков D1 и Dфотосистемы II хлоропластов (Окаda et al., 1996), ингибируя фотосинтез, подобно DCMU и бромоксинилу. При этом нарушается функция ФСII хлоропластов, и исчезает ее вклад в ПКС.

Блокирование ФСII посредствам бромоксинила или диурона значительно снижало CN–– индуцированное разрушение ядер устьичных клеток на свету (рис. 9).

Рис. 8. Действие БР и БО на дыхание и фотосинтетическое выделение О2 насечками листьев (НЛ) гороха. Линия 1 – контроль, линии 2 и 3 – БР, линия 3 – нормирована с линией 1 по скорости дыхания. НЛ в дистил воде без БР (линия 1) или 100 мкМ БР (линия 2) подвергали вакуум-инфильтрации и затем инкубировали 1 ч на белом свету. Вк и Вык – включение и выключение света.

Добавки: НЛ массой 20–25 мг/мл, 100 мкМ БО. Скорости поглощения О2 (эндогенное дыхание) и фотосинтетического выделения О2 в контроле составляли 400–800 и 280–мкмоль/г НЛ. Добавки: 100 мкМ БО.

Рис. 9. Влияние диурона и бромоксинила на CN–-индуцированную гибель УК из листьев гороха. Инкубация с КСN-20 ч. Добавки: 10 мкМ диурона, мкМ бромоксинила, 200 мкМ НСТ, 2,5 мМ КСN.

Вклад различных АФК в CN– –индуцированное разрушение ядер устьичных клеток в эпидермисе из листьев гороха. Апоптоз устьичных клеток, индуцированный CN–, зависит от АФК (Самуилов и др., 2000). Какова природа АФК H2O2 усиливал CN––индуцированный апоптоз устьичных клеток в эпидермисе из листьев гороха, регистрируемый по разрушению клеточных ядер (таблица 1). Ещё большее разрушение ядер наблюдалось от комбинации H2O2 и NADH – субстратов пероксидазы клеточной стенки растений, вызывающей образование О2· и H2O2 (Yokota, Yamazaku, 1977; Halliwell, 1978). NADH сам по себе вызывал некоторое разрушение ядер устьичных клеток. Разрушение ядер устьичных клеток при воздействии CN– или CN– + H2O2 полностью снималось НСТ. Сам по себе НСТ не влиял на состояние ядер устьичных клеток. Восстановленный НСТ накапливался в клетках в виде кристаллов формазана. Маннитол использовали в качестве ловушки для ·ОН. Он снижал CN–-индуцированное разрушение ядер устьичных клеток. Другой ловушкой для ·ОН является этиловый спирт. Он тоже снижал разрушение ядер, вызванное CN–. БР вызывал небольшое разрушение ядер в темноте, но не на свету. БР и TMRE, фотосенсибилизирующие генерацию 1O2, подавляли цианидное разрушение клеточных ядер на свету. Это подавление снималось добавленным NADH, который реагирует с O2 с образованием О2·. В темноте БР не оказывал влияние на CN–-индуцированное разрушение ядер, а на свету предотвращал его. Сходный, но менее выраженный эффект на свету оказывал TMRE. Предотвращение апоптоза, вызванного CN– в присутствии БР на свету, снималось NADH.

Таблица 1. Влияние соединений, стимулирующих или подавляющих образование различных АФК, на состояние устьичных клеток гороха Добавлен Разрушение ядер УК (%) в присутствии Тестируемая ные Условия реагентов + KCN или АФК опыта реагентов реагенты KCN + H2O2* KCN Темнота, 18 ч 0 35,0 ± 3,0 НСТ Свет, 18 ч 0 68,8 ± 3,9 О2· Темнота, 18 ч 0 87,0 ± 3,0* НСТ + H2OСвет, 18 ч 0 99,0 ± 1,0* Темнота, 18 ч 0 35,0 ± 3,0 87,0 ± 3,H2OСвет, 18 ч 0 68,8 ± 3,9 99,0 ± 1,H2OH2O2 + Темнота, 20 ч 54,3 ± 8,6 25,3 ± 1,5 NADH Свет, 20 ч 44,2 ± 2,9 79,0 ± 2,0 Темнота, 20 ч 0 42,5 ± 3,0 14,7 ± 2,Маннитол Свет, 20 ч 0 75,7 ± 5,0 42,0 ± 4,ОН· Этанол Свет, 24 ч 0 81,7 ± 4,4 24,5 ± 4,Темнота, 16 ч 2,8 ± 1,5 21,2 ± 2,3 20,6 ± 2,БР Свет, 23 ч 0 94,2 ± 4,0 1,0 ± 1,TMRE Свет, 19 ч 0 64,9 ± 4,3 41,8 ± 6,OБР + NADH Свет, 23 ч 0 94,2 ± 4,0 75,6 ± 3,Темнота, 20 ч 21,5 ± 7,NADH Свет, 20 ч 23,6 ± 8, Действие ингибиторов энергетического обмена на образование АФК. Гибель клеток может быть программируемой (апоптоз, аутофагия) и непрограммируемой (некроз). Форма гибели клеток во многом определяется их энергетическим состоянием. Клетка, обедненная АТР, погибает через некроз. Апоптоз зависит от АТР. Устьичные клетки погибали через апоптоз при действии разобщителя окислительного и фотосинтетического фосфорилирования (Дзюбинская и др., 2006). Ингибирование гликолиза посредством ДГ тоже вызывало апоптоз. Опыты с применением PI показали, что комбинация ХКФ и ДГ вызывала нарушение клеточных мембран, некротическую гибель клеток, при этом клеточные ядра УК сохранялись – признак некроза.

DCMU предотвращал CN–-индуцированный апоптоз устьичных клеток, но такой эффект снимался разобщителем ХКФ (Дзюбинская и др., 2006). Некоторые из испытанных ингибиторов энергетического обмена (ХКФ, DCMU и особенно БГ), как показывают данные с DCF, увеличивают выход флуоресценции красителя (рис. 10). ХКФ, по-видимому, ускоряет гидролиз диацетата DCFH. Зависимый от Н2О2 и ХКФ (величина рК составляет 5,95) рост флуоресценции красителя, измеряемый в отсутствие пленок эпидермиса, замедлялся или прекращался при рН 5,0 или 8,0. Действие DCMU связано с генерацией 1О2 и последующим окислением NAD(P)H (внутриклеточного) с образованием О2· и Н2О2 (Petrat et al., 2003). Ингибирование альтернативной оксидазы митохондрий растений гидроксаматами (БГ) усиливает образование О2· (Саmacho et al., 2004) и Н2О2. Согласно предположению, изложенному ранее (Самуилов и др., 2002; 2003), апоптоз УК регулируется редокс-состоянием пластохинона на участке о b6fцитохромного комплекса хлоропластов. Если пластохинон на участке о окислен или вытеснен конкурентным ингибитором, апоптоз УК предотвращается. Вызванное ХКФ снятие действия DCMU (рис. 11), подавляющего апоптоз устьичных клеток в присутствии CN–, может быть вызвано изменением редокс-состояния пластохинона: стимулируя циклический перенос электронов с участием фотосистемы I и b6f-комплекса, разобщитель влияет на компоненты циклической цепи, переводит пластохинон на участке о в менее окисленное состояние и, одновременно подавляя фотосинтетическое и окислительное фосфорилирование (но не субстратное фосфорилирование при гликолизе), включает ПКС. Из рис. 11 видно также, что комбинация DCMU и антимицина А, ингибирующих фотосинтетический перенос электронов в хлоропластах миксотиазола и бензилгидроксамата, ингибирующих дыхание митохондрий, ингибитора гликолиза ДГ и разобщителя ХКФ в течение 20 ч на свету не вызывает разрушение ядер УК. Смесь была дополнена цианидом, чтобы подавить разложение Н2О2 с участием каталазы и пероксидаз. Это вызывало разрушение ядер.

Рис. 10. Действие ингибиторов энергетического обмена на образование DCF из DCFH в пленках эпидермиса из листьев гороха. Добавки: 100 мкМ менадиона, 1мМ Н2О2, 10 мкМ ХКФ, 2,мМ КСN, 10 мкМ DCMU, 10 мМ ДГ, мкМ миксотиазола (Микс), 5 мМ бензилгидроксамата, 5 мкМ антимицина А (Ант).

Рис. 11. Разрушение ядер устьичных клеток в эпидермисе из листьев гороха на свету при действии ингибиторов энергетического обмена. Пленки эпидермиса после инфильтрации с 10 мкМ DCMU, 10 мкМ ХКФ, 5 мкМ миксотиазола, 5 мМ бензилгидроксамата, 5 мкМ антимицина А и мМ ДГ инкубировали 30 мин в темноте, затем, где указано, проводили инфильтрацию с 2,мМ КCN и инкубировали 20 ч на свету.

Влияние CN– на H2O2-зависимое образование DCF: данные флуоресцентной микроскопии. CN– обладает множественным действием: ингибирует гемовую каталазу и пероксидазы, в том числе аскорбатпероксидазу хлоропластов, цитохром c-оксидазу митохондрий, Сu,Zn- супероксиддисмутазу, инактивирует рибулозо-1,5бисфосфаткарбоксилазу/оксигеназу, подавляя регенерацию NADP+ из NADPH. CN– ингибировал Н2О2-зависимое образование DCF в клетках листьев гороха. После добавления KCN и DCFHDA, флуоресценция DCF наблюдалась в хлоропластах и вокруг них (локализацию хлоропластов определяли по флуоресценции хлорофилла), а также в области ядра клетки (Bartoli et al., 1977;

Patton et al., 1980; Kuroda et al., 2005).

Образование АФК в митохондриях. DCF в хлоропластах и клеточных ядрах флуоресцирует и в отсутствие CN– (рис. 12, а). При изменении глубины оптического среза хлоропласты становились невидимыми, свечение DCF в ядерной зоне усиливалось, появлялись светящиеся сферические структуры (рис. 12, б). Этиловый эфир тетраметилродамина вызывал яркое свечение сферических структур (рис. 12, в, г), которое исчезало при обработке пленок эпидермиса протонофорным соединением ХКФ, снимающим мембранный потенциал – (рис.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»