WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

Несмотря на то, что разработанная методика прямого определения бетаинов в крови с применением ТФЭ полностью решает поставленную задачу, она представляется весьма трудоёмкой и требует довольно большого объёма крови.

Кроме того, было желательно ускорить продолжительность анализа с 30-40 до 1015 мин.

Разработка такой улучшенной методики была выполнена нами благодаря использованию колонок с гетероповерхностными (дифильными) сорбентами, которые за рубежом получили название «RAM-adsorbents».

Такие неподвижные фазы обычно синтезируются на основе силикагеля. К наружной поверхности частиц силикагеля прививаются гидрофильные радикалы, а к внутренней – гидрофобные. При хроматографировании образцов крови, содержащиеся в ней молекулы гидрофильных полимеров – белков - из-за стерических причин не могут проникнуть во внутренний объем частиц сорбента и колонкой не удерживаются, тогда как низкомолекулярные вещества, пройдя гидрофильный поверхностный барьер, удерживаются внутренней гидрофобной фазой.

Для определения бетаинов в крови нами впервые был применены дифильные сорбенты, внутренняя поверхность зерен которых представляла собой немодифицированный силикагель. Изучались два гетероповерхностных сорбента.

Лучшие результаты получены на колонке с неподвижной фазой "Si-600–бромпропилтрихлорсилан–альбумин", где роль гидрофильного барьера для белков играл химически привитый альбумин.

Ход анализа существенно упростился и сводидся к следующим операциям:

1. В образец крови объемом 0,5 мл добавляли 50 мкл трихлоруксусной кислоты.

2. Раствор с образовавшимся осадком части белков фильтровали под давлением через фильтр с порами 0,2 мкм.

3. 200 мкл фильтрата упаривали до 50 мкл под вакуумом 4. 15-20 мкл полученного раствора хроматографировали.

Типичная хроматограмма приведена на рис. 9.

Использование дифильных сорбентов значительно уменьшило время анализа за счет ускорения процедуры подготовки пробы с сохранением метрологических характеристик методики.

Рис. 8. Хроматограмма образца плазмы крови на колонке с гетероповерхностным сорбентом.

Хроматограф: Милихром 4, УФ детектирование 198 нм, колонка: 2х80 мм, заполнена Si-600–бромпропилтрихлорсилан–альбумин; элюент: 70% ацетонитрила в 0,1 М фосфатном буфере, рН 6,2.

1– глицинбетаин, 2– -аланин–бетаин, 3– -треонин-бетаин (карнитин), 4- бетаин -аминомасляной кислоты, 5– милдронат (триметилгидразинийпропионат).

Нами показано, что динамическое модифицирование силикагеля можно применять не только в колоночной, но и в тонкослойной хроматографии.

Как и в случае колоночной хроматографии, силикагельные пластины для ТСХ можно проводить в двух вариантах: для реализации режима ДИРФ и для эмуляции обращенной (гидрофобной) фазы. Во втором варианте мы добавляли в элюент фосфат тетрабутиламмония или бромистый цетилтриметиламмоний (цетримид).

Таблица 3. Изменение механизма удерживания под действием модификатора Значения Rf веществ при использовании следующих элюентов:

Вещества Элюент без Элюент с добавкой Элюент с добавкой модификатора цетримида соли Молочная 0,87 0,92 0,кислота Гидрохинон 0,98 0,84 0,Нафталин 1,00 0,44 0,Следует отметить, что эмулирование на пластинке обращенной фазы достигается только при её предварительной промывки элюентом, содержащим соль соответствующего тетраалкиламмония (0,001 - 0,005М) в 0,001М фосфорной кислоте.

Из таблицы 3 видно, что добавление в элюент цетримида приводит к существенному удерживанию нафталина, что говорит о достижении в этих условиях обращенно-фазового режима хроматографии.

ВЫВОДЫ 1. Обнаружен новый режим модифицирования силикагеля в колоночной и тонкослойной жидкостной хроматографии, названный нами динамически индуцированным разделом фаз (ДИРФ), проявляющийся в виде разделения фаз элюента в результате добавления в него значительного количества неорганических солей.

2. Предложена модель ДИРФ и изучены основные закономерности этого явления. Показано, что оно наблюдается в водно-ацетонитрильных подвижных фазах при концентрации фосфатов, начиная с 0,05 М, причем величина концентрации соли однозначно определяет пороговое содержание ацетонитрила в элюенте, выше которого наблюдается разделение фаз.

3. Исследовано хроматографическое поведение сильнополярных веществ на колонках с силикагелем в подвижных водно-ацетонитрильных фазах с различной концентрацией дигидрофосфата калия при разных значениях рН. Найдено, что для хроматографии бетаинов оптимальной является подвижная фаза вода:

ацетонитрил=30:70, содержащая 0,1 М КН2РО4 (рН 6,2).

4. Разработаны ВЭЖХ методики определения бетаинов в крови на колонке с силикагелем со стадией концентрирования бетаинов на картриджах с силикагелем в режиме ДИРФ и прямого определения бетаинов в крови на колонке с дифильным сорбентом, внутренняя поверхность частиц которого представляет собой немодифицированный силикагель. При УФ детектировании при длине волны нм предел обнаружения бетаинов в крови составил не менее 0,2 мкг/мл.

Погрешность определения концентрации бетаинов в крови на уровне 0,8 мкг/мл составила около 6%.

5. Изучены возможности и ограничения использования динамического модифицирования в практике ТСХ. Показана применимость этого методического приема для практических целей.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Л.В. Сапрыкин, А.А. Сердан, Л.В. Сапрыкина. Прямой анализ бетаинов в биологических жидкостях методом ВЭЖХ.,// «Сорбционные и хроматографические процессы». Т.6., Вып. 1, 2006г. стр. 114-122.

htpp://www.anchem.ru/chemanalysis/2005/039-045/asp.

2. Л.В. Сапрыкин, Л.В. Сапрыкина. Некоторые аспекты практического применения динамического модифицирования в ВЭЖХ на силикагелевых сорбентах. // «Сорбционные и хроматографические процессы». Т.6, Вып. 2, 2006г.,. стр. 284-301.

3. Л.В. Сапрыкин, Л.В. Сапрыкина Современные аспекты динамического модифицирования в ВЭЖХ. // Сборник «Хроматография на благо России», Москва, «ИД Граница», 2007г. стр. 282-4. Л.В. Сапрыкин, Л.В. Сапрыкина. Динамическое модифицирование сорбентов в практике тонкослойной хроматографии. //Тезисы доклада Всероссийского симпозиума «Хроматография и хроматографические приборы». Москва, 2004г.

5. Л.В. Сапрыкин, Л.В. Сапрыкина. Динамическое модифицирование хроматографических систем в практике ВЭЖХ. //Тезисы доклада. Всероссийской конференции «Теория и практика хроматографии. Применение в нефтехимии». г.Самара, 2005г., стр. 6. Л.В. Сапрыкин, Л.В. Сапрыкина Возможности и перспективы применения гидрофильной хроматографии в практике ВЭЖХ. // Тезисы доклада. X Международная конференция « Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии», Москва-Клязьма, 2006г.

7. Л.В. Сапрыкина, Л.В. Сапрыкин Перспективы использования динамического модифицирования в практике тонкослойной хроматографии. // Тезисы доклада. X Международная конференция «Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии», Москва-Клязьма 2006г. с. 239.

8. Л.В. Сапрыкин, Л.В. Сапрыкина Гидрофильная хроматография как частный случай динамического модифицирования хроматографических систем в ВЭЖХ. // Тезисы доклада. Всероссийский симпозиум «Хроматография в химическом анализе и физхикохимических исследованиях, Москва-Клязьма 2007г., с. 9. Л.В. Сапрыкина, Л.В. Сапрыкин Динамически индуцированный раздел фаз как граничный случай гидрофильной хроматографии. //Тезисы доклада. Всероссийский симпозиум «Хроматография в химическом анализе и физхико-химических исследованиях, Москва-Клязьма 2007г., с.

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»