WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Можно предположить, что примерно такое же расслоение происходит и на поверхности сорбента. В случае алкилсиликагелей и других неполярных фаз, образуется достаточно толстая пленка жидкости (рис. 1), состоящая из почти чистого ацетонитрила с небольшим содержанием воды, примерно соответствующая по составу азеотропу.

Рис. 1. Упрощенная схема формирования динамически индуцированного раздела фаз на поверхности октадецилсиликагеля.

Удерживание происходит преимущественно по распределительному механизму, а не по сольвофобному, как это было бы в отсутствие соли. Сорбат распределяется между двумя жидкими фазами: ацетонитрил и водноацетонитрильно-солевой раствор. Полярность ацетонитрила гораздо выше, чем у алкильной фазы, а потому растворимость полярных сорбатов в такой НЖФ значительно больше, что сказывается на константе распределения вещества между подвижной и неподвижной фазами, а соответственно – и на его удерживании.

Кроме того, значительно меньшая разница в полярности фаз способствует гораздо более быстрому установлению сорбционного равновесия и более интенсивному массообмену, а достаточно большая толщина неподвижной фазы обусловливает меньше стерических затруднений при сорбции, поскольку позволяет распределить в своем объеме относительно крупные молекулы сорбатов. Нельзя исключить и существование некоторой диффузионной области между фазово разделенными жидкостями, где концентрация ацетонитрила увеличивается постепенно по мере приближения к поверхности алкилсиликагеля. Однако образование такой области возможно лишь при сольватации ионов соли ацетонитрилом, но однозначных экспериментальных подтверждений протекания такого рода процессов не получено.

Уже при содержании соли в элюенте, составляющем 70 – 80% от уровня его гетерогенизации, расслоение за счет капиллярного эффекта происходит на поверхности основных пор сорбента, а в мелких порах оно может начинаться еще при более низких концентрациях соли (порядка 60%).

Этот эффект можно наблюдать визуально, если поместить гомогенный элюент близкого к расслоению состава в кварцевый капилляр внутренним диаметром 0,1 мм.

Такой граничный режим динамического модифицирования хроматографической системы можно назвать «динамически индуцированным разделом фаз» (ДИРФ), поскольку реализуется вариант хроматографии на разделе фаз двух несмешивающихся жидкостей, образованном при взаимно опосредованном воздействии на поверхность сорбента компонентов элюента.

Следует отметить, что для осуществления индуцированного раздела фаз подойдут силикагели и с другими химически пришитыми фазами, такими как нитрил-, амин- или диол-. Соответственно хроматографические свойства таких систем будут несколько отличаться от аналогичных свойств хроматографических систем на основе октадецилсиликагеля за счет, например, специфических взаимодействий сорбата с привитыми к силикагелю группами.

Весьма перспективно использование и обычных силикагелей совместно с элюентами на основе водно-органических смесей с солевыми добавками в элюент, типичными для обращенно-фазовой ВЭЖХ. Небезуспешные попытки разделения некоторых смесей сорбатов в таких системах делались еще с начала 80-х годов прошлого века. Известно также, что при работе с элюентами, содержащими значительные количества воды, на обычном силикагеле не удается добиться приемлемого удерживания большинства сорбатов без добавления в элюент специальных динамических модификаторов.

Качественное разделение, например, становится возможным при добавке в элюент полиаминов, тетраалкиламмониевых солей и других катионогенных ПАВ, формирующих на силикагеле поверхность с определенными свойствами. Помимо этого, добавка в элюент солей органических и неорганических кислот позволяет добиться аналогичного эффекта. Можно использовать, например, соли хлорной, фосфорной и муравьиной кислот. Двум последним отдают предпочтение, когда необходимо стабилизировать рН элюента за счет их буферных свойств.

Такая разновидность хроматографии активно используется в последние несколько лет и даже получила название - гидрофильная хроматография, в англоязычной хроматографической литературе больше известная как HILIC (Hydrophilic Interaction LIquid Chromatography).

Этот режим позволяет хроматографировать высокополярные вещества преимущественно основного характера и используется чаще в системах ВЭЖХМС, когда применение ион-парных реагентов мешает работе массспектрометрического детектора.

Органические основания способны к довольно сильным взаимодействиям с силанольными группами силикагеля даже в водных растворах. Можно предположить, что благодаря кислому характеру силанольных групп, в данном варианте реализуется ионообменный режим сорбции. Добавки же небольших количеств солей приводят к ослаблению ионо-обменных взаимодействий за счет конкурирующего влияния катионов.

Можно предположить, что при работе на обычных силикагелях с использованием водосодержащих элюентов добавка более значительных количеств соли в элюент также приводит к динамически индуцированному разделу фаз, но у поверхности сорбента остается пленка жидкости, содержащая воду и гидратированные ионы соли в больших концентрациях, по сравнению с их концентрациями в элюенте (рис. 2).

Образуется пленка очень полярной НЖФ, состоящей из водного раствора соли, фазово отделенная от элюента, содержащего значительные количества ацетонитрила, а потому гораздо менее полярного. То есть, раздел фаз протекает по такой же схеме, что и на алкилсиликагеле, однако картина инвертирована. Режим разделения также остается нормально-фазовым, но все, что касается толщины пленки НЖФ и скорости установления межфазного концентрационного равновесия, претерпевает те же изменения, как и в случае обращенно-фазового режима.

Рис. 2. Упрощенная схема формирования раздела фаз на поверхности силикагеля.

Этот вариант можно рассматривать как граничный режим гидрофильной хроматографии (HILIC-режима).

В пользу образования на поверхности сорбента границы раздела двух фаз свидетельствует ряд экспериментально выявленных нами особенностей, присущих только этому режиму на силикагеле.

Симметричная форма пиков полярных соединений говорит о том, что изотерма адсорбции линейна, а это более характерно для распределительного механизма.

Уменьшение эффективности колонки, связанное, видимо, с увеличением толщины слоя НЖФ на поверхности сорбента, что, в свою очередь, затрудняет диффузию (ионов) сорбата через толщу пленки НЖФ до границы раздела фаз.

Аномально сильное влияние состава элюента на удерживание сорбатов.

Фактор удерживания может измениться вдвое при изменении состава элюента всего на несколько процентов.

Удерживание сорбатов гораздо сильнее зависит от температуры колонки, чем в других вариантах ВЭЖХ.

Режим крайне чувствителен к структуре и размеру пор используемого силикагеля.

ДИРФ на обычном силикагеле имеет наибольшие потенциальные возможности, так как хорошо проявляет себя при разделении высокополярных веществ как кислого, так и основного характера, анализ которых традиционно сложен при использовании других режимов ВЭЖХ. Некоторое снижение эффективности колонки по отношению к этим соединениям, не представляется принципиальным, поскольку при других режимах ВЭЖХ эффективность снижается гораздо больше, в первую очередь, за счет мешающего ионного обмена.

В то же время липофильные сорбаты в этом режиме практически не удерживаются в колонке и выходят вблизи мертвого объема, что вполне логично и ожидаемо с точки зрения рассмотренного предполагаемого механизма сорбции.

Это обстоятельство делает применение ДИРФ очень выгодным при анализе полярных сорбатов в биологических пробах, содержащих значительные количества жиров, липидов и аналогичных им липофильных соединений.

Потенциальные возможности ДИРФ наиболее наглядно проявляются при анализе веществ, практически не определяемых на нужном уровне и в сложных объектах при других режимах ВЭЖХ.

В таблице 2 представлены структуры 4 бетаинов и бетаиноподобного вещества – милдроната.

На примере этих и некоторых других очень полярных соединений можно увидеть некоторые закономерности и особенности проявления режима ДИРФ.

Только в нормально-фазовом варианте ДИРФ нам удалось, например, разделить четыре бетаина и лекарственное вещество "кардиопротектор" со структурой и свойствами, близкими к бетаинам, (рис. 3). В других условиях они практически не удерживаются в колонке даже при использовании ион-парного режима, а применение ионообменных сорбентов дает большое уширение пиков, не позволяющее достигнуть нужного уровня детектирования.

Таблица 2. Структура 4 бетаинов и бетаиноподобного вещества – милдроната, используемых для приготовления модельных смесей.

CHГлицинбетаин (N, N, N – CH3 N+ CH3 COO- 1 триметиламиноацетат) CH - аланин - бетаин CH(3-(N, N, N – триметиламино)- COOCH3 N+ CH2 CHпропионат) CH-треонина-бетаин (карнитин) CH(N, N, N – триметиламино)-2CH3 N+ CH2 CH CH2 COOоксибутират CH3 ОН -аминомасляная кислота CH(4-(N, N, N – триметиламино)CH3 N+ CH2 CH2 CH2 COOбутират) CHМилдронат- CH(N, N, N – триметилгидразиний)5 CH3 N+ NH CH2 CH2 COOпропионат CHРис. 3. Хроматограмма модельной смеси бетаинов.

Хроматограф: Милихром 4, УФ детектирование 198 нм, колонка: 2х80 мм, заполнена Separon SGX мкм; элюент: 70% ацетонитрила в 0,1 М фосфатном буфере, рН 6,2. 1– глицинбетаин, 2- -аланин– бетаин, 3- -треонин-бетаин (карнитин), 4- бетаин -аминомасляной кислоты, 5– милдронат (триметилгидразинийпропионат). Концентрация веществ в пробе – по 0,1 мг/ мл.

На рис. 4 показана зависимость фактора удерживания от концентрации ацетонитрила в элюенте для карнитина и молочной кислоты. Хорошо видно, что для сорбата кислого характера зависимость проще, и наблюдается лишь порог резкого увеличения удерживания, соответствующий, видимо, переходу хроматографической системы в режим ДИРФ. До этого момента удерживание данного сорбата очень слабо зависит от содержания ацетонитрила, проявляя лишь некоторую тенденцию к росту при увеличении его концентрации.

Для бетаина наблюдается локальный максимум малой интенсивности в интервале от 20 до 40 % ацетонитрила, который, вероятнее всего, соответствует удерживанию этого сорбата по ионообменному механизму на кислых силанольных группах за счет аммонийного азота. В пользу этого же предположения свидетельствует отсутствие подобного максимума для кислого сорбата.

k' 0 10 20 30 40 50 60 карнитин молочная к-та С, % Рис. 4. Зависимость удерживания карнитина и молочной кислоты от концентрации ацетонитрила в элюенте с 0,1 М фосфатным буфером (рН 7,4).

Этот интервал соответствует разделению оснований в режиме гидрофильной хроматографии, где достигаются вполне приемлемые для ВЭЖХ значения удерживания. Далее, как и для молочной кислоты, наблюдается резкое увеличение удерживания, обусловленное появлением раздела фаз на поверхности сорбента.

В области режима ДИРФ с ростом значения рН до 4 удерживание бетаинов также возрастает в среднем вдвое (рис. 5), что связано, очевидно, с образованием цвиттер-ионов, изменением характера сольватации и повышением полярности сорбатов. Именно из-за влияния рН на удерживание данных сорбатов, в качестве соли и был выбран дигидрофосфат калия, обладающий рН буферной ёмкостью.

При фиксированной концентрации ацетонитрила в элюенте и увеличении концентрации фосфатного буфера можно наблюдать постепенное увеличение удерживания сорбатов и уменьшение асимметрии пика (рис. 6). И в этом случае наблюдается заметное увеличение удерживания вблизи концентрации расслоения.

Тем не менее, до этого момента также существует область концентраций фосфатного буфера, где достигаются вполне приемлемые значения факторов удерживания.

Коэффициент асимметрии пика в режиме ДИРФ, как правило, не превышает 1,3–1,4, а для некоторых полифункциональных сорбатов может принимать значения чуть менее единицы. Это обстоятельство позволило предположить, что в данном режиме даже следовые количества полярных веществ не будут подвержены необратимой сорбции в колонке.

k' бутиробетаин карнитин бетаин рН Рис. 5. Зависимость удерживания бетаинов от рН элюента.

Исходя из зависимостей величины факторов удерживания от состава элюента, очевиден вывод, что можно добиться примерно одинаковых параметров хроматографической системы при различных концентрациях ацетонитрила в элюенте, варьируя при этом лишь содержание дигидрофосфата калия. На практике же, для реализации режима ДИРФ с фосфатным буферным раствором наиболее удобно работать в интервале концентраций ацетонитрила от 50 до 80 %. При меньшем его содержании в элюент приходится добавлять слишком большие количества соли, которая в этих условиях склонна к образованию пересыщенных растворов и при некоторых обстоятельствах может выпасть в осадок прямо в колонке. Более значительные концентрации ацетонитрила в элюенте также неудобны в работе, поскольку интервал приемлемых концентраций соли сужается, что затрудняет процедуру приготовления элюента. Кроме того, за счет снижения общей концентрации дигидрофосфата сильно падает буферная емкость элюента, и стабилизация значения рН затрудняется.

k', ka 0 0,01 0,02 0,05 0,07 0,1 0,удерживание асимметрия С, М Рис. 6. Зависимость удерживания (k) и асимметрии (ka) пика карнитина в зависимости от молярной концентрации фосфатного буферного раствора в элюенте, содержащего 70 % ацетонитрила.

Возможность подбором состава элюента ощутимо менять фактор удерживания всех бетаинов позволила нам на основе этой же хроматографической системы разработать методику выделения, очистки и концентрирования бетаинов из плазмы крови, основанную на твердофазной экстракции (ТФЭ).

В качестве сорбционной системы для проведения ТФЭ оптимально использовать ту же систему, что и для хроматографирования бетаинов, но в граничных условиях (максимальное удерживание – минимальное удерживание).

Соответственно для этих целей были использованы ТФЭ-картриджи «Диапак Sil», объемом 1 мл, заполненные немодифицированным силикагелем (Силасорб 600) с зернением 30-50 мкм (ЗАО «БиоХимМак», г. Москва).

Очищенный и сконцентрированный образец хроматографировали. Типичная хроматограмма показана на рис. 7. Предел обнаружения бетаинов в крови составил около 0,2 мкг/мл. Погрешность определения бетаинов в крови при их концентрации 0,8 мкг/мл не превышает ±6%.

Рис. 7. Хроматограмма нативных бетаинов из плазмы крови, выделенных методом ТФЭ. Условия разделения в подписи к рис. 3. 1– глицинбетаин, 2– -аланин–бетаин, 3- -треонин-бетаин (карнитин), 4- бетаин -аминомасляной кислоты.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»