WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Электрофорез белков проводили по методу Laemmli (1970) в полиакриламидном геле (ПААГ) с 0.1%-ным SDS с линейным градиентом акриламида (6-15%). Количественную оценку оптической плотности полос на радиоавтографах осуществляли с помощью программы TotalLab. 2.0. (США).

Эксперименты проводили в трех биологических повторностях от 2–х до 9 раз.

Процедуру иммуноблоттинга (оборудование производства BioRad, США) и гибридизацию с антителами к ТГ, pТГ-Ser40, HDAC1, AcH3, AcH4 (антитела фирмы Cell Signaling, США) проводили в соответствии с протоколами, рекомендованными производителями.

Содержание дофамина и L-ДОФА в гипоталамусе, стриатуме и гиппокампе головного мозга крыс анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с УФ- детекцией.

Статистическая оценка результатов. Результаты обрабатывались с помощью программ Statsoft Statistica 6.0. (Microsoft Corp., США), REST Tool V1.9.9 (Corbertt Research, CША), BiQ_Analyser (http://biq-analyser.bioinf.mpi-inf.mpg.de/), BioEdit V.

5.0.9. (США). Достоверности различий групповых средних оценивались с помощью дисперсионного анализа. На графиках представлены средние значения с учетом стандартной ошибки среднего.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Краткая характеристика изучаемого препарата. Бромпроизводное 2аминоадамантана ладастен (N-(2-адамантил)-N-парабромфениламин), синтезированный и фармакологически изученный в ГУ НИИ фармакологии им. В.В.

Закусова РАМН, разработан в качестве лекарственного средства, обладающего психостимулирующими, селективными анксиолитическими и иммунотропными свойствами (Морозов и соавт., 1993; Середенин и соавт., 2001; Яркова и соавт., 2001).

Препарат обладает также антиоксидантной, детоксицирующей активностью, повышает резистентность организма к действию различных экстремальных факторов.

Физико-химические особенности молекулы ладастена, в частности, липофильность, определяют фармакокинетические свойства препарата, а именно, способность интенсивно и быстро распределяться в органы и ткани экспериментальных животных и человека, а также проникать через гематоэнцефалический барьер. Показано, что уже через 10 мин после однократного per os введения (100 мг/кг, 2% ПЭГ-400) препарат обнаруживается в мозге крыс, а максимальный уровень препарата регистрируется через 60 мин (Сергеева, Красных, 1994). Как показывают проведенные ранее психофармакологические, нейрохимические, электрофизиологические исследования, нейротропные эффекты ладастена обусловлены сложным модулирующим влиянием на центральные дофамин-, серотонин- и ГАМКергические системы мозга (Морозов и соавт., 2001), однако, механизмы формирования и реализации комплекса психотропных активностей препарата остаются во многом неясными. В связи с этим в настоящей работе основное внимание было уделено изучению молекулярных механизмов, определяющих и обосновывающих психостимулирующие свойства ладастена.

2. Экспрессия гена тирозингидроксилазы в разных структурах головного мозга крыс под действием ладастена и механизмы его регуляции. Как уже отмечалось выше, ладастен, наряду с другими веществами, проявляющими психостимулирующую активность, обладает способностью увеличивать содержание нейромедиаторов – дофамина (ДА) и серотонина преимущественно в лимбических структурах мозга (во фронтальной коре, гиппокампе, гипоталамусе), стимулировать высвобождение дофамина из пресинаптических терминалей стриатума (Кудрин и соавт., 1995; Грехова и соавт., 1995) и ингибировать обратный захват дофамина, норадреналина и серотонина изолированными синаптосомами головного мозга крыс (Морозов и соавт., 1999). Предположения о способности ладастена активировать биосинтез нейромедиатора подтвердились в экспериментах с блокадой ДОФАдекарбоксилазы специфическим ингибитором 3-оксибензгидразином. Было установлено, что ладастен в условиях ингибирования ДОФА-декарбоксилазы способствует накоплению в стриатуме и фронтальной коре L-ДОФА, что может быть следствием прямого влияния препарата на биосинтез и/или активность тирозингидроксилазы в клетках мозга (Lapa et al., 2005).

2.1. Влияние ладастена на экспрессию гена и белка тирозингидроксилазы и содержание дофамина в различных структурах головного мозга крыс. Как известно, в вентральной области покрышки сконцентрированы тела дофаминергических нейронов, дающих проекции в вентральный стриатум, в том числе в прилежащее ядро, гиппокамп, лобную кору, гипоталамус, миндалину и другие структуры лимбической системы мозга. Это определяет широкие функции мезолимбической системы – участие в механизмах формирования памяти, эмоций, обучения, нейроэндокринной регуляции. Кроме того, ДА нейроны мезолимбической системы мозга являются нейрохимическим субстратом подкрепления и “награды”, а также вовлекаются в механизмы действия многих психостимулирующих веществ (амфетамин, какоин) и определяют их аддиктивный потенциал (Robinson et al., 1993;

Di Chiara, 1995). Принимая во внимание данные психофармакологических и нейрохимических исследований ладастена (Кудрин и др., 1995; Грехова и др., 1995) нами был проанализирован ряд параметров, характеризующих динамику состояния системы биосинтеза катехоламинов при однократном введении препарата, а именно - содержание L-ДОФА и дофамина, оценка экспрессии гена и белка тирозингидроксилазы (ТГ) в вентральной области покрышки, прилежащем ядре, гипоталамусе, стриатуме, и гиппокампе крыс.

Наши исследования выявили определенную специфичность влияния ладастена на динамику экспрессии гена и белка ТГ, а также накопление L-ДОФА и ДА в зависимости от отдела мозга. Так, однократное введение ладастена вызывает быстрое (уже через 30 мин) увеличение уровня мРНК гена ТГ в вентральной области покрышки.

Рис. 1. Влияние ладастена на уровень экспрессии мРНК гена тирозингидроксилазы в вентральной области покрышки.

Уровень мРНК гена ТГ показан относительно уровня мРНК гена «домашнего хозяйства» PGK.

* - cтатистически значимые различия при p<0,Как видно из рис.1, максимальный уровень мРНК гена ТГ отмечается через 1.5.

ч после введения препарата. Обращает на себя внимание быстрота и длительность ответа данного гена на воздействие ладастена, что, вероятно, свидетельствует об индукции de novo транскрипции гена ТГ в данной структуре мозга. Содержание LДОФА и ДА изучали в прилежащем ядре, где локализованы терминали ДАсодержащих нейронов, проецирующихся из вентральной области покрышки. Данные, представленные на рис. 2 показывают, что уровень дофамина в этой структуре увеличивается уже через 1 ч после введения ладастена и достигает максимальных значений через 2 ч. Иная динамика накопления отмечена для L-ДОФА: через 2 ч после введения препарата наблюдается значительное возрастание уровня L-ДОФА, сохраняющееся на высоком уровне и через 2.5 ч.

Рис. 2. Влияние ладастена на содержание ДА и L-ДОФА в прилежащем ядре (в % к контролю).

* - cтатистически значимые различия при p<0,Таким образом, ладастен при однократном введении увеличивает уровень мРНК ТГ в вентральной области покрышки, и это коррелирует с динамикой накопления L-ДОФА и ДА в прилежащем ядре и максимумом проявлений поведенческих эффектов ладастена. Отметим, что способность ладастена оказывать позитивное влияние на ДА нейропередачу именно в вентральной области покрышки - прилежащем ядре подтверждает наличие выраженных психостимулирующих свойств препарата. В то же время, способность индуцировать de novo биосинтез катехоламинов, детектируемый по накоплению L-ДОФА, определяет “неистощающий” тип действия ладастена, выгодно отличающий препарат от “классических” психостимуляторов.

Как показывают результаты наших исследований, однократное введение ладастена сопровождается изменениями уровня L-ДОФА и дофамина в гипоталамусе (рис. 3а). Как видно из рис. 3б в клетках гипоталамуса индуцируемые ладастеном изменения уровня мРНК гена и белка ТГ имеют линейный характер, достигая максимума к 2 ч после однократного воздействия препарата, и коррелируют с содержанием продукта реакции - L-ДОФА. Увеличение уровня рТГ-Ser40 в гипоталамусе происходит через 1 ч после введения препарата, а максимальное значение данного показателя отмечено через 2 ч. Данные, представленные на рис. 3, свидетельствуют о влиянии ладастена не только на de novo синтез ТГ, но и на активность фермента, следствием чего является увеличение уровня L- ДОФА и дофамина в этой структуре в сопоставимых временных интервалах.

Как известно, отдельные популяции ДА-содержащих нейронов гипоталамуса опосредуют центральную регуляцию поведенческих и эндокринных функций за счет ко-локализации с клетками, продуцирующими нейрорегуляторные пептиды (Maurer et al. 1997). Таким образом, активация ладастеном синтеза дофамина в гипоталамусе, выполняющего роль нейромедиатора, нейромодулятора и нейрогормона в этой структуре, может, по крайней мере, частично, обуславливать опосредованную ДАнейронами регуляцию нейроэндокринных функций и, как следствие, реализацию стресспротекторных, метаболических, иммуномодулирующих эффектов препарата.

а) б) Рис. 3. Влияние ладастена на содержание в гипоталамусе крыс: а) L-ДОФА и дофамина, б) на экспрессию гена и уровень белка тирозингидроксилазы и рТГ-Ser40.

В стриатуме через 0.5 ч после воздействия уровень ДА и в большей степени LДОФА значительно снижается (рис. 4а). Однако, к 2-2.5 ч содержание L-ДОФА увеличивается почти в два раза. Влияние ладастена на экспрессию гена и белка ТГ в стриатуме представлено на рис. 4б. Через 0.5 ч уровень мРНК гена ТГ значительно ингибирован (20%) и сохраняется приблизительно на том же уровне до 1.5 ч наблюдений (33% от уровня контрольных значений). Интересно, что в стриатуме ладастен во всех исследованных промежутках времени не оказывает влияния на содержание белка ТГ, тогда как незначительное повышение уровня рТГ-Serпроисходит через 0.5 ч после введения препарата, а в период между 1-1.5 ч наблюдаем снижение уровня рТГ-Ser40.

Ранее было показано, что ладастен длительно стимулирует высвобождения ДА из дорсального стриатума крыс (Грехова и соавт., 1995). Подобный эффект является характерным для психостимуляторов типа кокаина, амфетамина и ряда его производных, вызывающих усиление высвобождения ДА в стриатуме, сопровождающееся истощением внутриклеточного пула нейромедиатора (Shishido et al., 1997). Способность ладастена стимулировать накопление L-ДОФА в стриатуме и других исследованных структурах мозга крыс может свидетельствовать в пользу потенциальной противопаркинсонической активности препарата, направленной на основное патогенетическое звено паркинсонизма.

б) а) Рис. 4. Влияние ладастена на содержание в стриатуме крыс: а) L-ДОФА и дофамина, б) на экспрессию гена и уровень белка тирозингидроксилазы и рТГ-Ser40.

Как следует из рис. 5а, в гиппокампе содержание и L-ДОФА и ДА через 1.5 ч после введения ладастена увеличивается почти в 3 раза, и практически не изменяется во всех остальных исследованных временных промежутках. Как следует из рис. 5б, существенных изменений уровня мРНК ТГ в данной структуре под действием ладастена не выявляется: во всех исследованных временных интервалах данный показатель находится на уровне контрольных значений. Что касается влияния препарата на изменение содержания белка ТГ в гиппокампе, то, небольшое повышение данного показателя отмечается через 0.5 ч, и более значительное - через 1.5 ч после введения ладастена. Влияние ладастена на уровень рТГ-Ser40 в гиппокампе отражено на рис. 4б, из которого следует, что незначительное увеличение уровня рТГ-Ser40 происходит через 0.5 ч после введения препарата, оставаясь на уровне значений контроля во всех остальных временных интервалах.

Увеличение уровня L-ДОФА и ДА в этой структуре представляется интересным, поскольку известно, что дофаминергические нейроны гиппокампа вовлекаются в процессы консолидации памяти, что продемонстрировано многими исследователями на in vivo и in vitro моделях долговременной потенциации (Frey et al., 1990, 1991).

а) б) Рис. 5. Влияние ладастена на содержание в гиппокампе крыс: а) L-ДОФА и дофамина, б) на экспрессию гена и уровень белка тирозингидроксилазы и рТГ-Ser40.

3. Влияние ладастена на характер метилирования остатков цитозина в промоторной области гена тирозингидроксилазы в клетках гипоталамуса головного мозга крыс. Несмотря на то, что к настоящему времени механизмы тканеспецифической регуляции экспрессии гена ТГ достаточно полно и подробно исследованы, немногое известно о роли эпигенетических механизмов в регуляции экспрессии данного гена. В качестве одного из возможных механизмов, обуславливающих изменение транскрипционной активности гена ТГ под действием исследуемого нами препарата, мы предположили возможность его влияния на характер метилирования цитозина в СрG-динуклеотидах в промоторной его области.

Анализ эффектов ладастена (однократное внутрижелудочное введение, декапитация через 1.5 ч) на характер метилирования цитозинов в 5-фланкирующей области гена ТГ, экспрессирующегося в клетках гипоталамуса, проводили методом бисульфитного секвенирования. Этот метод позволяет определять статус метилирования всех CpGдинуклеотидов в исследуемом фрагменте ДНК.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что ладастен при однократном введении экспериментальным животным вызывает изменение характера метилирования СрG-динуклеотидов, локализованных в 5'-фланкирующей области гена ТГ в клетках гипоталамуса головного мозга крыс. Оно проявляется в увеличении частоты деметилирования остатков цитозина в последовательностях, расположенных непосредственно в сайтах связывания транскрипционных факторов АР-2 (в позиции 218), Egr-1/Sp-1 (-117), CRE-1 (-43), CRE-2 (-95) или в непосредственной близости от них – AP-2 (-228, -225), HEPT (-156, -143, -140), Egr-1/Sp-1 (-134), AP-1-CRE-enhancer element (-19, -8) (рис. 6). Как показывают результаты наших исследований, в опытном варианте частота метилирования цитозина в позиции -43 CRE-1-элемента снижена почти в 2 раза по сравнению с контролем, тогда как остаток цитозина в позиции -95, расположенный в сайте CRE-2, деметилирован в меньшей степени.

Можно предположить, что наблюдаемое нами усиление транскрипционной активности гена ТГ в клетках гипоталамуса, по крайней мере, частично ассоциировано с процессами метилирования/деметилирования цитозинов CREпоследовательности промоторной области данного гена. Нами также установлено, что ладастен индуцирует деметилирование цитозина в положении -218, локализованного непосредственно в последовательности АР-2, и 2-х цитозинов в позициях -228 и -225, прилегающих к сайту связывания данного транскрипционного фактора.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»