WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Чтобы решить эту задачу достаточно наглядно, следовало проанализировать контакты структуры типа поли-l-пролин II на одиночных участках полипептидных цепей белков, а этому условию, как известно, удовлетворяют линкерные участки. Поэтому в данной работе был предпринят поиск линкерных участков полипептидных цепей в белках, среди них выделены ДНК-связывающие белки, а далее проанализирована стереохимия вторичных структур линкерных участков этих белков и среди них отобраны те, которые находятся в левой спирали типа поли-l-пролинп II, будучи в комплексе с ДНК.

Для поисков линкерных участков использовались базы данных PDB, SCOP, а также база данных линкеров: http://ibivu.cs.vu.nl/.

Метод поиска линкеров оригинален: из базы данных SCOP сначала выбирались домены по ряду сформулированных признаков.

Участок пептида между доменами трактовался как линкер.

Рассматривали и подвергали дальнейшему стереохимическому анализу только цельные линкеры. Обратим внимание на важность линкерных участков для ДНК-белкововго узнавания: разрыв линкера обычно сопряжен с патологией.

Глава 3. Термодинамический анализ механизмов влияния имнокислот – пролина и оксипролина на физические характеристики коллагенов.

В этой главе приводятся основные результаты анализа влияния иминокислот на термодинамические характеристики структур коллагенового типа в коллагенах из различных источников.

Установлено, что основной механизм увеличения энтропии системы белок-вода при увеличении содержания иминокислот в полипептидной цепи состоит в изменении числа кооперативных участков, выявляющихся при плавлении фибриллярной макромолекулы. Разброс физических характеристик кооперативных единиц определяет, в частности, разброс значений параметров водородных связей, что проявляется в уширении полос NH-валентных колебаний, т.е. в уширении полуширин переходов в постденатурационных структурах. Таким образом, основной механизм влияния иминокислот на термодинамические характеристики коллагенов связан со сложным ходом процесса денатурации, при котором механизмы дегидратации-гидратации нативного и денатурированного состояний существенно меняются при замене любых аминокислот на иминокислоту.

В данной главе, помимо акцента на анализ уникальной структуры обращается внимание на то, что коллаген является системным белком, определяющим значительное число процессов структурообразования в биологических объектах на разных уровнях их организации, прежде всего – на клеточном и тканевом. Однако, невзирая на значительное количество работ, затрагивающих самые разные стороны структурообразования и функционирования коллагенов, принципиального прорыва в понимании закономерностей образования и стабилизации этих белковых структур до сих пор нет.

Достаточно большая неопределенность в наших знаниях о белковых структурах связана с иминокислотами, которые, как оказалось, не только играют ключевую роль в стабилизации трехцепных макромолекул коллагенов, но и они же определяют необычные физические свойства коллагеновых макромолекул.

Пролин входит в список основных, так называемых, кодируемых аминокислот и обладает уникальной химической структурой. Из-за наличия пирролидинового цикла в нем отсутствует N-H-группа, способная при адсорбции воды служить донором водородной связи.

Тот же пирролидиновый цикл фиксирует двугранный угол в основной цепи в районе -60°, создавая тем самым существенные конформационные ограничения.

Пролин наилучшим способом подходит для третьего типа вторичной структуры белков – левой спирали типа поли-l-пролин II (пп II). Спираль обладает псевдо симметрией С3 и служит основой фибриллярной части коллагена, представляющего собой уникальный комплекс трех спиралей типа поли-l-пролин II, и также достаточно часто встречается в глобулярных белках.

Растворимость пролина в воде доходит до 7 М, в то же время он хорошо растворим в водноспиртовых смесях с большим содержанием спирта. CO-группа пролина более электроотрицательна, чем соответствующие карбонильные группы других аминокислот и является поэтому наиболее сильным акцептором протонов.

Расположение водных мостиков вокруг одиночной полипептидной цепи поэтому зависит расположения иминокислот. При включении пролина в полипептидную цепь из-за уменьшения количества и хаотизации распределения доноров протонов в полипептидной цепи сокращаются в размерах области кооперативной гидратации пептидных групп, т.е. растет энтропия одиночной полипептидной цепи.

Мы провели термодинамический анализ результатов калориметрии коллагенов, выделенных из животных, далеких в таксономическом отношении, по следующим причинам. Во-первых, коллагены имеют специфическую структуру, термостабильность которой соответствует температурным условиям среды обитания. Вовторых, эта структура стабилизируется водой, причем упорядоченная гидратная оболочка образуется на основе карбоксильных CO-групп полипептидной цепи, т.е. при образовании водной спирали вокруг трехцепной макромолекулы коллагена не используются NH-группы, т.е. пептидный азот.

Специфическая водная структура вокруг коллагенов – единственный пример образования кооперативной сетки воды вокруг полипептида без NH-группы как донора протонов. Кооперативная сетка воды вокруг денатурированной одиночной цепи коллагена принципиально другая: NH-группы аминокислот являются важными опорами сетки H-связей вокруг левой спирали типа поли-l-пролин II в аминокислотном полипептиде.

Таким образом, в процессе денатурации коллагена должна происходить перестройка спирали гидратной воды, т.е. изменяться геометрия и деформироваться симметрия спирали воды.

Каков же механизм перехода в денатурированное состояние с участием иминокислот Две группы данных: термодинамические характеристики переходов в коллагенах, во-первых и изменения в спектрах водородных связей в процессах денатурации – во вторых – могут подсказать, какие стадии процесса денатурации определяют этапы изменения стабильной полипептидной трехцепной спирали и как регулируется этот процесс.

Важно отметить еще раз, что коллагены – белки с уникальной фибриллярной структурой: средняя величина проекции остатка на ось спирали в коллагенах с различным аминокислотным составом, в том числе и содержанием иминокислот, определяемая методом рентгеноструктурного анализа, постоянна и составляет 2,86. Таким образом, изменение физических свойств коллагенов определяется не изменениями их пространственной структуры, но физикохимическими свойствами пептидных групп и боковых радикалов.

В Табл. 1 приведены параметры тепловых переходов для макромолекул коллагенов с разным содержанием иминокислот.

Таблица 1. Термодинамические характеристики коллагенов разного происхождения.

Q, кал/г Кол-во Энтропия, Источник Число --------- T, Td Heff, коопера- ккал/ коллагена имино- H, полуширина К ккал/ тивных моль К Из кожи кислот ккал/моль Перехода моль участков, /1000 а.к. белка N= H/ Heff 10,65 11,3 13,Трески 155 -------- 2,0 292,3 10,0 12,9 12,Мерланга 160 -------- 2,5 294,6 12,0 14,5 14,R. temp. 165 -------- 2,5 304,4 13,4 18,8 15,R. ridib. 171 ------- 3,0 310,5 13,6 16,6 16,Щуки 199 -------- 2,5 303,2 17,0 18,0 19,Крысы 226 -------- 2,3 312,9 17,2 19,1 19,Курицы 228 ------- 2,5 318,1 Как известно из калориметрических данных, с ростом количества иминокислот растут и энтальпия и энтропия денатурационных переходов. Долгое время полагали, что объяснение может состоять в дополнительных молекулах воды, адсорбируемых на тройной спирали коллагена в местах концентрации аминокислот.

Однако, эксперименты показывают, что гидратация коллагена ткане- но не видоспецифична, т.е. не коррелирует с содержанием иминокислот. В то же время в денатурированном состоянии упорядоченность систем NH-связей (по полуширине полос NHвалентных колебаний) падает с ростом числа иминокислот в макромолекуле, что и объясняет рост энтропии системы белок-вода.

В данных Табл.1 обращает на себя внимание увеличение числа кооперативных единиц при плавлении коллагенов по мере увеличения количества имииокислот.

Это можно понять, если учесть, что первый этап процесса денатурации коллагенов - это дегидратация тройной спирали макромолекулы*. При этом в местах локализации иминокислот на участках левой спирали типа поли-l-пролин II постденатурационная гидратация не происходит, что и приводит к разобщению участков тройной спирали коллагена на различные кооперативные единицы*.

Рассмотрим одну из простейших моделей этого процесса, позволяющих продемонстрировать эффект неоднородного уширения в колебательных спектрах. Рассмотрим длинную линейную молекулу, на которой имеются какие-либо молекулярные группы, расположенные на одинаковом расстоянии друг от друга. Т.е. эти группы образуют своего рода одномерную линейную периодическую решетку. Если мы рассмотрим колебательный спектр этих групп, то он будет достаточно узок, поскольку все эти группы находятся в одинаковых условиях и неоднородное уширение отсутствует. Но если из-за дегидратации части пептидных групп молекула перестает быть однородной и периодичность нарушается, то разные молекулы будут * Подчеркнем, что при денатурации коллагена должна происходить перестройка гидратной оболочки спирали, а по данным В.И. Лобышева энергетика денатурационного перехода в коллагене определяется водой.

давать линии колебаний, сдвинутые друг относительно друга.

Соответственно по сравнению с нативным состоянием суммарный спектр окажется уширенным.

Таким образом, механизм роста энтропии переходов в коллагенах под влиянием иминокислот связан со следующими этапами: 1) дегидратацией пептидных групп в местах расположения иминокислот; 2) разделением кооперативных областей на несвязанные части; 3) вариацией параметров NH-валентных колебаний в различных кооперативных единицах; 4) разрывом NH- пептидных связей; 5) лабиализацией динамики в местах расположения иминокислот.

Поэтому тонкая регуляция термостабильности коллагенов иминокислотами осуществляется как за счет изменения числа кооперативных участков в еще нативной структуре, так и за счет нарушения кооперативной гидратации постденатурационной одиночной левой спирали типа поли-l-пролин II в местах включения в нее иминокислот.

Глава 4. Левая спираль типа поли-l-пролин II в линкерных областях ДНК-связывающих белков В этой главе изложены результаты исследований взаимодействий ДНК-левая спираль типа поли-l-пролин II. По базам данных белков и линкеров, как это описано в Методах, в рамках данной главы проведен поиск участков линкеров в конформации типа поли-l-полин II, в составе комплексов ДНК-белок. В PDB найдено комплексов РНК-белок и 778 комплексов ДНК-белок. В них найдено 1260 линкерных участков. Среди них найдено 73 комплекса линкерДНК. Показано, что средняя длина участков левой спирали типа ппII составляет шесть остатков, причем пролин в них не является доминирующим остатком.

Знание доменной структуры белков, существенное в аспекте структуры и функций этих важнейших макромолекул, предполагает, наряду с информацей о доменах, сведения о междоменных областях или о так называемых линкерах. В отличие от доменных субъединиц (компактных, структурно независимых образований в составе белковой глобулы) линкеры не характеризуются плотной упаковкой, не образуют контактов с доменами белков но, вместе с тем, нередко являются самостоятельными структурными и функциональными единицами белка. Для нас линкеры интересны как пример непосредственных трехспиральных комплексов между одиночными левыми спиралями типа поли- l-пролин II и ДНК.

Мы провели разметку вторичной структуры для всех найденных линкеров. Отличие от ранее применённых методов разметки вторичной структуры состоит в использовании более точного разделения структур по классам, и впервые добавлен тип вторичной структуры типа поли-l-пролин-II, составляющий существенную долю всех встречающихся в белках конформаций. В существующей базе данных линкеров разметка левой спирали отсутствует.

Для нас особый интерес представляет взаимодействие линкеров в лево-спиральной конформации с ДНК. Оказалось, что левоспиральные линкеры в основном располагаются в узкой бороздке ДНК, но в ряде случаях мы нашли их и в широкой.

Мы рассматрели все лево-спиральные линкеры предполагая, что при определенных условиях возможно образования комплексов белок-нуклеиновая кислота (см. Табл. 2). Показано, что средняя длина левоспирального линкера составляет шесть остатков, аминокислотный состав: Gln, Pro, Arg, Lys, Ile.

Наибольший интерес представляют левоспиральные линкеры, непосредственно контактирующие с ДНК или РНК (мы проанализировали 23 примера). В диссертации представлен большой графический материал.

Таблица 2. Фрагменты линкеров в конформации левой спирали типа поли-l-пролин II в комплексах c ДНК, содержащие пролин.

Идентификатор Номера Аминокислотная последовательность белка и цепи в остатков банке PDB Pdb1ecr_A 229-237 Ile Lys Arg Pro Val Lys Val pdb1ecr_A 279-300 Tyr Asp Ala Asp Asn Val Gln His Arg Tyr Lys Pro Gln Ala Gln Pro Leu Arg Leu Ile pdb1fiu_A 52-70 Ser Glu Thr Val Ser Glu Arg Leu Pro Gly Gln Thr Ser Gly Asn Ala Phe pdb1mse_C 138-148 Asn Pro Glu Val Lys Lys Thr Ser Trp pdb1qf6_A 529-536 Ala Gly Phe Phe Pro Thr pdb2up1_A 88-108 Ala Val Ser Arg Glu Asp Ser Gln Arg Pro Gly Ala His Leu Thr Val Lys Lys Ile pdb6pax_A 62-77 Ile Arg Pro Arg Ala Ile Gly Gly Ser Lys Pro Arg Val Ala В главе приводится ряд примеров контактов левоспиральных линкеров с ДНК и РНК. Отмечается, что симметрия расположения пролиновых остатков не допускает образования кооперативной сетки воды, длиной, большей одного витка спирали волы. Контакты, как и предполагалось, допускают возможность правильного расположения оси симметрии второго порядка, перпендикулярной оси ДНК, и псевдо оси симметрии второго порядка левоспирального участка.

Глава 5. Обсуждение результатов В главе проведено общее обсуждение данных глав 3 и 4, с привлечением данных по расчетам гидратации пептидов, с различным расположением пролина в полипептидной цепи. Приведем только короткое резюме.

В данных Табл.1 и Рис. 3 обращает на себя внимание увеличение числа кооператиных единиц при плавлении коллагенов по мере увеличения количества иминокислот.

Рисунок 3. Зависимость числа кооперативных единиц в коллагенах различного происхождения от содержания иминокислот.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»