WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

БЕЛКИНА Светлана Владимировна ПРОГНОЗИРОВАНИЕ СИНЕРГИЗМА МУТАГЕННЫХ, КАНЦЕРОГЕННЫХ И ЛЕТАЛЬНЫХ ЭФФЕКТОВ ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ РАЗЛИЧНЫХ ФАКТОРОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ 03.00.01 – радиобиология и 03.00.16 – экология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Обнинск – 2007 2 Диссертация выполнена в биофизической лаборатории отдела исследования комбинированных воздействий ГУ–Медицинский радиологический научный центр Российской академии медицинских наук Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Петин Владислав Георгиевич кандидат биологических наук Комарова Людмила Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Красавин Евгений Александрович доктор биологических наук, профессор Сынзыныс Борис Иванович

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии Россельхозакадемии

Защита диссертации состоится 24 апреля 2007 г. в 11.00 ч на заседании диссертационного совета Д 001.011.01 при ГУ «Медицинский радиологический научный центр Российской академии медицинских наук» по адресу: 249036, Калужская обл., г. Обнинск, ул.

Королёва, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ–МРНЦ РАМН

Автореферат разослан 22 марта 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Палыга Г.Ф.

3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из самых острых проблем современности является борьба за чистоту окружающей среды. Живые организмы в окружающей среде постоянно подвергаются воздействию целого комплекса факторов (Виленчик М.М., 1991). Эти факторы могут встречаться в последовательной комбинации или действовать одновременно. Большую опасность представляют соединения, обладающие мутагенным действием.

Кроме непосредственного отрицательного эффекта на живые организмы они вызывают отдалённые последствия, которые могут проявиться в виде раковых образований или реализоваться в последующих поколениях (Москалев Ю.И., 1991).

Многообразие воздействующих на организм агентов делает актуальной проблему изучения закономерностей комбинированных воздействий и их математического моделирования с целью прогнозирования ожидаемых последствий (Данилов-Данильян В.И., Степанов С.А., 2002). К настоящему времени в отечественной и зарубежной литературе накопились экспериментальные данные по комбинированным воздействиям в окружающей среде многих физических и химических факторов. Ситуация усложняется тем, что вредное действие некоторых агентов может не только суммироваться, но и усиливаться за счёт синергического взаимодействия.

Поэтому прогнозирование мутагенных, канцерогенных и летальных эффектов при синергическом взаимодействии различных факторов окружающей среды является актуальным как для радиобиологии, так и для экологии.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является прогнозирование летальных, генетических и канцерогенных эффектов при синергическом взаимодействии различных факторов окружающей среды. Для выполнения этой цели было необходимо решить следующие задачи:

– продемонстрировать на экспериментальных данных, что характер взаимодействия агентов при комбинированных воздействиях зависит от соотношения индуцированных ими повреждений;

– сформулировать и адаптировать для генетических и канцерогенных эффектов математическую модель синергизма, ранее использованную для описания только летальных эффектов;

– проверить применимость модели синергизма для прогнозирования мутагенных эффектов на клеточном уровне;

– оценить возможность использования модели синергизма для описания канцерогенных эффектов при комбинированных воздействиях факторов окружающей среды на организменном уровне и на уровне человеческой популяции.

Научная новизна работы. В результате выполнения данной работы впервые были получены следующие новые результаты:

• математическая модель синергизма, первоначально разработанная для описания летальных эффектов на клеточном уровне, адаптирована и успешно применена для прогнозирования мутагенных эффектов у бактерий Escherichia coli, а также более сложных биологических организмов - растений;

• разработана модифицированная модель синергизма, учитывающая элиминацию субповреждений, которая оптимизирует и прогнозирует мутагенные эффекты комбинированного действия различных экологических агентов;

• впервые продемонстрирована возможность использования математической модели синергизма для оптимизации и прогнозирования синергических эффектов канцерогенеза в культивируемых клетках млекопитающих, а также у лабораторных животных;

• впервые показана возможность применения модели к описанию канцерогенных эффектов комбинированных воздействий экологических агентов на популяционном уровне (человек).

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты работы имеют, прежде всего, фундаментальное значение, поскольку дополняют современный уровень представлений о синергических взаимодействиях.

Результаты данной работы использованы в материалах учебных пособий для студентов вузов. Также они могут представлять интерес для экологии, прикладной радиобиологии, медицинской и сельскохозяйственной радиологии при разработке оптимальных режимов промышленной, сельскохозяйственной и медицинской стерилизации. Результаты данной работы могут быть использованы при составлении практических рекомендаций санитарно-гигиенических служб.

Основные положения, выносимые на защиту.

- Математическая модель синергизма прогнозирует величину максимального синергического усиления и условия, при которых она достигается после одновременного действия гипертермии и сульфата цинка на выживаемость бактерий Escherichia coli, а также последовательного действия метотрексата и этилметансульфата на выживаемость культивируемых клеток млекопитающих.

- Возможно применение математической модели синергизма, проверенной ранее для описания инактивации клеток, для прогнозирования выхода мутаций у бактерий Escherichia coli.

- Математическая модель синергизма количественно описывает и интерпретирует данные о выходе мутаций и цитогенетических повреждений у растений.

- Математическая модель синергизма может быть использована для прогнозирования канцерогенных эффектов комбинированных воздействий на клеточном уровне, а также на популяционном (человек).

Личный вклад автора в получение научных результатов, изложенных в диссертации. Совместно с научным руководителем автором обоснованы актуальность, цели и задачи исследования, самостоятельно проанализирована научная литература, получены экспериментальные данные, проведен количественный анализ результатов, сделаны выводы, написана диссертация.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертации доложены на Международном рабочем совещании "Современные проблемы радиобиологии" (Дубна, 1996), на 3-м Съезде по радиационным исследованиям (Москва, 1997), на VIII Международном Конгрессе Генетиков (Пекин, 1998), на региональной научно-практической Конференции "Инновационное развитие: достижения учёных Калужской области для народного хозяйства" (Обнинск, 1999), на Четвёртой Всероссийской научнопрактической конференции с международным участием "Новое в экологии и безопасности жизнедеятельности" (Санкт-Петербург, 1999), на научной конференции "Физико-технические проблемы гарантии качества лучевой терапии" (Обнинск, 2006). По теме диссертации опубликовано 16 работ в журналах «Генетика», «Радиационная биология. Радиоэкология», «Радиация и риск», «Российский химический журнал», «Экология», а также в материалах научных конференций.

Диссертация апробирована на межлабораторной научной конференции экспериментального радиологического сектора ГУ–МРНЦ РАМН 21 декабря 2006 г.

Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на 161 странице, включает введение, обзор данных литературы, результаты экспериментальных и теоретических исследований, обсуждение, выводы, список использованной литературы и Приложение. Иллюстрирована рисунками и 17 таблицами, список цитируемой литературы включает работ на русском языке и 137 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Влияние комбинированного действия ионизирующего излучения и NiClна выживаемость и формирование повреждений ДНК в культивируемых клетках человека Клеточная культура. Для исследования были использованы клетки ТК6 Влимфобластов человека, гетерозиготных по тимидинкиназе. Клетки пересевали дважды в неделю и культивировали в среде RPM1 с добавлением 20 % сыворотки крови эмбриона теленка, 1 % NEAA (не незаменимые кислоты) и 1 % пируват натрия. Поскольку ТК6 клетки не присоединяются к стенкам пластиковых флаконов, в которых они культивируются, то для сбора их в суспензию добавление трипсина не требовалось. В ходе экспериментов клеточную культуру инкубировали в термостате при температуре 37ОС с 5 %-ым содержанием СО2 в воздухе камеры при 100 % влажности.

Облучение. Источником ионизирующего излучения служила установка Cs-137 с мощностью дозы, равной 0,8 Гр/мин. Клеточную суспензию (2·105 клеток/мл) облучали в пластиковых флаконах при комнатной температуре. После облучения культуру возвращали в термостат с СО2.

Выживаемость клеток. Для определения выживаемости клеток клеточную суспензию разбавляли до концентрации 2·105 клеток/мл в питательной среде при комнатной температуре и 10 мл суспензии помещали в пластиковые флаконы. Необходимые микрообъемы NiCl2 отбирали из основного 1 М раствора и вводили непосредственно в клеточную суспензию. Клетки ТК6, находящиеся в экспоненциальной стадии роста, инкубировали в средах с добавлением исследуемых концентраций NiCl2 в течение 24 ч или 48 ч.

Выживаемость клеток рассчитывали по уравнению:

S = nэксп./nконтр. * 100 %, (1) где nэксп. – число выживших клеток в облученной группе, а nконтр. – число жизнеспособных клеток в контрольной группе. Концентрацию клеток определяли при помощи камеры Горяева под световым микроскопом.

Различие между погибшей и живой клеткой определяли «на глаз», принимая во внимания различную способность клеток отражать свет.

Статистическая обработка результатов. Обработку экспериментальных данных производили в соответствии с общими методами, принятыми при статистическом анализе результатов наблюдений. Достоверность различий статистических показателей оценивали по t-критерию Стьюдента при р 0,05.

Комбинированное действие агентов. Клетки инкубировали в среде, содержащей исследуемую концентрацию хлорида никеля, в течение 24 ч в термостате. Затем клетки облучали в дозе 1 Гр при комнатной температуре.

Определение выживаемости клеток после сочетанного воздействия ионизирующего излучения и химического агента проводили через 24 ч после облучения. Результаты последовательного действия агентов на выживаемость клеток ТК6 представлены на рис. 1.А. Из рисунка следует, что если при низких концентрациях хлорида никеля наблюдается эффект, больший, чем аддитивный (синергизм), то при высоких - меньший, чем аддитивный эффект (антагонизм). Коэффициент синергического усиления по экспериментальным значениям рассчитывали как отношение количества повреждений, формируемых в реальных экспериментах по комбинированному действию агентов, к суммарному числу повреждений, 100 1,1,Б А 1,1,0,0,0,0,0 2 4 6 0,1 1,0 10,0 100,N/NКонцентрация NiCl2, х10-4М Рис. 1. Комбинированное действие ионизирующего излучения (1Гр) и различных концентраций хлорида никеля на выживаемость B-лимфобластов человека ТК6. А – Зависимость выживаемости клеток от концентрации NiCl2. Темные кружки – воздействие NiCl2, 48 ч. Темные треугольники – комбинированное действие излучения и NiCl2. Значок на оси ординат – эффект действия только 1 Гр. Данные – результаты 5-ти независимых экспериментов.

Пунктирная кривая - ожидаемая кривая выживаемости при независимом (аддитивном) действии этих агентов. Б – Зависимость коэффициента синергического усиления от отношения повреждений N2/N1, индуцированными воздействующими агентами. N1 – число летальных повреждений, вызванных излучением (уравнение 3), N2 – хлоридом никеля.

сформированных после раздельного действия каждого агента.

, (2) kэксп = Nкомб / Nаддит где (3) Ni = - ln(S), где S – доля выживших клеток. Как показано на рис. 1.Б, величина коэффициента синергического усиления, рассчитанная по уравнению (2) во всех случаях близка 1.

Метод «комет». Для регистрации повреждений ДНК, сформированных в клетке после комбинированного действия ионизирующего излучения и хлорида никеля, использовали метод «комет». Этот метод применяют для прямой визуализации повреждений ДНК в отдельно взятой клетке. В работе использовали щелочной метод электрофореза клеток для определения одиночных и двойных разрывов ДНК.

Клетки ТК6 были подвергнуты 24 часовому воздействию NiCl2, а после облучены при 0°С. Затем 5·104 клеток в 0,01 мл фосфатного буфера смешивали с 0,1 мл мелко молотого агара и помещали на замороженное предметное стекло, которое предварительно было покрыто первым слоем 0,1% агара при низкой температуре. После отвердения агара клетки внутри слоя агара были подвергнуты лизису в течении 60 мин при 4°С. Удаление протеинов ядра происходило в термостате при 37°С в течение 2 ч, затем клетки подвергали действию электрического поля 12 В/см в течение 60 мин.

После электрофореза клетки дегидрировали в 96% этаноле и регидрировали в Коэффициент Выживаемость, % синергического усиления R k А Б А В 3,1,2,L 1,W 1,0,10-N/NКонцентрация NiCl2, M Рис. 2. Последовательное действие различных концентраций хлорида никеля (0,6 – 2,3 10-4М) и ионизирующего излучения (цезий-137, 1 Гр) на формирование одиночных и двойных разрывов ДНК в клетках В-лимфобластов человека ТК6. А - флуоресцентная микрофотография «кометы», показан способ определения отношения длины кометы к ширине его ядра (R), где „L“ – общая длина кометы, а „W“ – ширина ядра. Б - зависимость отношения R от концентрации NiCl2.

Приведены данные одного эксперимента, в котором было проанализировано от 60 до 130 клеток на распечатанных микрофотографиях. В - зависимость коэффициента синергического усиления от отношения повреждений N2/N1, индуцированными воздействующими агентами. N1 – число генетических повреждений, вызванных излучением, N2 – хлоридом никеля.

70% этаноле, а затем окрашивали флуоресцирующим красителем Yo-Yo.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»