WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

Влияние ResD-ResE белков на экспрессию генов рибонуклеаз бацилл в клетках B.subtilis. Чтобы установить, участвуют ли регуляторные белки в контроле экспрессии генов рибонуклеаз, был исследован эффект мутаций в кодирующих их генах на активность РНКаз. Известно, что дефекты в ResD-ResE системе оказывают влияние на экспрессию генов Pho регулона в условиях фосфатного голодания [Sun et al., 1996а]. В наших исследованиях показано, что resD мутация негативно сказывается на уровне продукции биназоподобных рибонуклеаз. Специфическая активность рибонуклеаз Bi, Bpu и Bth в штаммах, дефектных по ResD белку, снижается по сравнению с уровнем РНКазной активности в штамме с полноценной регуляторной системой соответственно на 89, 87 и 94% (рис. 7). Полученные результаты согласуются с данными литературы о специфической активности щелочной фосфатазы, типичного представителя Pho регулона, в resD мутанте, которая также снижается на 80-90% от уровня активности в штамме дикого типа [Hulett, 1996]. Это позволяет сделать вывод о том, что белок ResD задействован в контроле экспрессии генов биназоподобных рибонуклеаз так же, как и других членов Pho регулона, т.е. является позитивным регулятором [Birkey et al., 1998; Schau et al., 2004].

Показано, что делеция гена киназы resE не приводит к утрате ферментативной активности рекомбинантными штаммами B.subtilis, несущими плазмиды с генами биназоподобных рибонуклеаз (рис. 7). Это объясняется тем, что ResD белок может быть фосфорилирован другими сенсорными киназами либо низкомолекулярными донорами фосфата, такими как ацетилфосфат [Laub and Goulian, 2007].

Отсутствие белков двухкомпонентной системы ResD-ResE не оказывает влияния на экспрессию гена РНКазы B.amyloliquefaciens и B.circulans в условиях фосфатного голодания. Однако наличие потенциальных сайтов

Рисунок 7. Экспрессия генов биназоподобных рибонуклеаз в дефектных по ResD и ResE белкам рекомбинантных штаммах B.subtilis.

А) Рост рекомбинантных штаммов. Б) рибонуклеазная активность.

Условные обозначения: штамм B.subtilis JH642 изображен белым цветом, B.subtilis LAB2234 (resE) – серым, B.subtilis LAB2506 (resD—) – черным; РНКаза Bi кружками, РНКаза Bpu – треугольниками, РНКаза Bth - квадратами.

связывания для белка ResD в промоторах всех гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл, свидетельствует о том, что данный фактор все же может регулировать экспрессию их генов, но, по-видимому, в других условиях.

Роль Spo0A белка в регуляции экспрессии генов рибонуклеаз бацилл в клетках B.subtilis. Исследование влияния Spo0A белка на экспрессию генов гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл проводили в штаммах, несущих мутации в самом гене spo0A (образование функционального регулятора ответа практически невозможно), гене его фосфатазы spo0E (гиперактивная фосфатаза делает Spo0A регулятор неактивным), а также в двойном spo0A/abrB мутанте (возможность проследить AbrB-опосредованный путь функционирования Spo0A белка).

Установлено, что мутация в гене spo0A негативно сказывается на продукции РНКазы Ba. Рибонуклеазная активность как в одиночном, так и в двойном spo0A/abrB мутанте практически отсутствовала (рис. 8). Полученный результат свидетельствует о том, что белок Spo0A является позитивным регулятором экспрессии гена рибонуклеазы B.amyloliquefaciens, и действует независимо от AbrB белка.

Специфическая активность барназы в spo0E мутантном штамме, в котором основная часть Spo0A белка присутствует в неактивной форме, соответствовала контролю (рис. 8). Этот результат в сравнении с тем, что получен с одиночным spo0A мутантом, позволяет полагать, что ген РНКазы Ва, по-видимому, активируется небольшими количествами фосфорилированного Spo0A

Рисунок 8. Экспрессия генов рибонуклеаз бацилл в рекомбинантных штаммах В.subtilis, дефектных по Spo0A, AbrB и Spo0E белкам.

Условные обозначения: уровень активности фермента в рекомбинантном штамме B.subtilis с полноценными регуляторными белками - белые столбики, активность РНКазы в мутантных штаммах – черные столбики.

регулятора. Присутствуя в клетках в стадии замедления роста в малых количествах, активный Spo0A регулятор выполняет важные функции. Он не только способствует высвобождению вторичных метаболитов, в том числе и гидролитических ферментов и антимикробных веществ, но и принимает участие в регуляции таких важных для популяции бактерий процессов, как бактериальный «апоптоз» и формирование колоний сложного типа - биопленок [Gonzalez-Pastor et al., 2003; Verhamme et al., 2009].

Активность рибонуклеазы Bci в исследуемых мутантных штаммах B.subtilis не отличалась от контроля (рис. 8). Следовательно, ее биосинтез не подвержен действию Spo0A белка. Отсутствие регуляции со стороны основных белков фосфатного регулона, а также альтернативного сигма В фактора [Морозова, 2000], который контролирует у B.subtilis неспецифический ответ на фосфатное голодание [Allenby et al., 2005], свидетельствует о том, что ген фосфат-зависимой рибонуклеазы B.circulans относится к группе малоизученных генов фосфатного стимулона, неспецифически индуцируемых при истощении фосфора в окружающей среде.

Несмотря на то, что в промоторах генов гуанилспецифичных рибонуклеаз В.intermedius, B.pumilus и B.thuringiensis сайтов, подобных 0А-боксам B.subtilis, выявлено не было (рис. 6), не исключена вероятность участия регулятора ответа Spo0A в контроле экспрессии генов этих РНКаз, так как известно, что данный белок контролирует множество процессов в клетке косвенно, влияя на транскрипцию других регуляторных белков, в частности AbrB [Molle et al., 2003].

В наших экспериментах было показано, что Spo0A белок является негативным регулятором экспрессии генов биназоподобных РНКаз, на что указывает значительное повышение РНКазной активности (в 5-6 раз) в Spo0A-дефектных штаммах (рис. 8). В двойных spo0A/abrB мутантах уровень РНКазной активности превышает контрольные значения лишь в 3 раза (рис. 8), что свидетельствует о том, что белок AbrB является позитивным регулятором. Результаты о влиянии Spo0A белка на экспрессию генов биназоподобных РНКаз согласуются с данными литературы для гена щелочной фосфатазы [Hulett, 1996] и подтверждают его AbrB-опосредованный эффект.

Эксперименты с мутантными штаммами не только подтвердили справедливость отнесения генов гуанилспецифичных рибонуклеаз к новым членам Pho регулона, но и способствовали решению практической задачи, нацеленной на получение суперпродуцентов этих важных с практической точки зрения ферментов.

Получение суперпродуцентов бациллярных рибонуклеаз. Существуют различные методы для получения микроорганизмов, характеризующихся способностью к повышенному синтезу целевого белка, которые успешно были применены в отношении бацилл-продуцентов гуанилспецифичных рибонуклеаз. В частности, использование принципов генной инженерии и мутагенеза позволило добиться 5 и 10-кратного увеличения активности биназы по сравнению с природным продуцентом [Балабан с соавт., 1992; Знаменская с соавт., 1999]. В настоящей работе мы предлагаем иной подход, основанный на устранении негативного регулятора синтеза целевого белка. Клонировав мультикопийную плазмиду с геном биназы в Spo0A-дефектный штамм B.subtilis, нам удалось увеличить выход фермента в 30 раз по отношению к природному штамму B.intermedius 7Р. К тому же использование для получения внеклеточных целевых белков spo0A-мутантного штамма-хозяина, имеет ряд неоспоримых преимуществ, в частности нарушения в синтезе протеолитических ферментов у таких бактерий способствуют продукции полноразмерных секретируемых белков [Kodama et al., 2007]. Более того, предложенный подход может быть положен в основу конструирования систем для экспрессии других важных белковых продуктов. Подобные системы должны включать ген целевого белка под контролем промотора биназоподобной рибонуклеазы и Spo0A-дефектный штамм-хозяина.

ВЫВОДЫ

1. Анализ секвенированных геномов бактерий рода Bacillus показал, что ортологи phoP, spo0A и resD генов B.subtilis, продукты которых контролируют специфический Pho ответ, представлены у всех бацилл, что позволило нам использовать B.subtilis в качестве модельного организма для изучения регуляции экспрессии генов гуанилспецифичных рибонуклеаз.

2. Основной регулятор Pho ответа – фактор транскрипции PhoP B.subtilis образует специфический комплекс с промоторами генов рибонуклеаз B.intermedius, B.pumilus и B.thuringiensis и не взаимодействует с промоторами РНКаз B.circulans и B.amyloliquefaciens.

3. В регуляторных областях генов гуанилспецифичных рибонуклеаз выявлены нуклеотидные последовательности, гомологичные сайтам связывания других регуляторных белков Pho регулона: ResD сайты – у всех исследуемых РНКаз, а Spo0А боксы – только у рибонуклеаз B.circulans и B.amyloliquefaciens.

4. В условиях фосфатного голодания экспрессия генов рибонуклеаз B.intermedius, B.pumilus и B.thuringiensis в рекомбинантных штаммах B.subtilis позитивно регулируется белком ResD, и негативно - белком Spo0A. Синтез рибонуклеазы B.circulans не зависит от этих регуляторов, в то время как экспрессия гена РНКазы B.amyloliquefaciens находится под позитивным контролем белка Spo0A.

5. Полученные результаты дают основание считать внеклеточные рибонуклеазы B.intermedius, B.pumilus и B.thuringiensis новыми членами фосфатного регулона, а рибонуклеазу B.circulans, в отличие от близкого структурного гомолога – фосфат-независимой РНКазы B.amyloliquefaciens, следует отнести к участникам неспецифического Pho ответа.

Публикации по теме диссертации

  1. Ульянова, В. В. Роль Spo0A и AbrB белков в регуляции экспрессии гена рибонуклеазы Bacillus pumilus в рекомбинантных штаммах Bacillus subtilis / В. В. Ульянова, В. И. Вершинина, М. Р. Шарипова // Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение: материалы XIII Международной научной конференции, Казань, 4-8 апр. 2005. - Казань: Казан. гос. ун-т. – С. 86-87.
  2. Ульянова, В. В. Роль белков системы Spo0A-фосфопереноса в регуляции экспрессии гена биназы в клетках Bacillus subtilis / В. В. Ульянова, В. И. Вершинина // Наука. Инновации. Бизнес: материалы V Республиканской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов, Казань, 9 июн. 2005. – Казань: Экоцентр, 2005. – С. 64-65.
  3. Ульянова, В. В. Роль белков системы Spo0A-фосфопереноса в регуляции экспрессии гена рибонуклеазы Bacillus intermedius в клетках Bacillus subtilis / В. В. Ульянова, В. И. Вершинина // Актуальные аспекты современной микробиологии: тезисы Всероссийской молодежной школы-конференции, Москва, 1-3 нояб. 2005. – С. 81.
  4. Ульянова, В. В. Экспрессия гена рибонуклеазы B.thuringiensis позитивно регулируется двухкомпонентной системой ResD-ResE B.subtilis / В. В. Ульянова, М. А. Золотова, В. И. Вершинина // Биология – наука XXI века: сб. тез. 10-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых, посвященной 50-летию Пущинского научного центра РАН, Пущино, 17-21 апр. 2006. - С. 56.
  5. Ульянова, В. В. Влияние Spo0A и AbrB белков на экспрессию генов гуанилспецифичных рибонуклеаз Bacillus intermedius и Bacillus pumilus в рекомбинантных штаммах Bacillus subtilis / В. В. Ульянова, В. И. Вершинина, М. А. Харитонова, М. Р. Шарипова // Микробиология. – 2007. – Т. 76, № 5. – C. 639-644.
  6. Ульянова, В. В. Регуляция экспрессии генов рибонуклеаз Bacillus thuringiensis и Bacillus circulans / В. В. Ульянова, М. А. Золотова, В. И. Вершинина // Материалы докладов XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», Москва, 11-14 апр. 2007. - М.: Издательский центр Факультета журналистики МГУ им. М.В. Ломоносова, 2007. - С. 29-30.
  7. Ульянова, В. В. Двухкомпонентная система ResD-ResE позитивно регулирует экспрессию генов гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл / В. В. Ульянова, М. А. Золотова, М. А. Харитонова, О. Н. Ильинская, В. И. Вершинина // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. – 2008. - №3. – C. 23-28.
  8. Ульянова, В. В. Системы, контролирующие специфический ответ бацилл на фосфатное голодание / В.В. Ульянова, В.И. Вершинина // Ученые записки Казанского государственного университета. Серия Естественные науки. – 2008. – Т. 150, кн. 2. – C. 231-244.
  9. Ульянова, В. В. Участие гуанилспецифичных рибонуклеаз Bacillus thuringiensis и Bacillus circulans в ответе клеток на фосфатное голодание / В. В. Ульянова, В. И. Вершинина // Биология: традиции и инновации в 21 веке: Сб. науч. тр. по материалам I Всероссийского, с международным участием, конгресса студентов и аспирантов биологов «Симбиоз Россия 2008», Казань, 6-10 июл. 2008. – Казань: Изд-во КГУ, 2008. - С. 35-36.
  10. Ulyanova, V. V. Role of sigma B factor in regulation of binase gene expression in Bacillus subtilis cells / V. V. Ulyanova, E. G. Glazunova, V. I. Vershinina // Building the Future in Biology “Bionews”: Proceedings of the First Interuniversity Conference on Modern Biology, Kazan, 24 Nov. 2008. – Kazan: Kazan State University, 2008. – P. 47.
  11. Ulyanova, V. V. Interaction of Bacillus subtilis PhoP regulator with promoter regions of guanyl-specific ribonuclease genes / V. V. Ulyanova // Microbial enzymes in biotechnology and medicine: XIV International conference devoted to the 20lh anniversary of partnership between Kazan State University and Justus-Liebig Giessen University, Kazan, 5-7 June 2009. – Kazan: Kazan State University, 2009. - P.
    Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»