WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

РНКаз Ba и Bci

5’-GAAAACGTCACATTGC-3’

RBaR

5’-TCATCATGTGAAGCTG-3’

FBpR

РНКаз Bi, Bpu Bth

5’-TTAATCGGAAAAGACG-3’

RBpR

5’-GAAGCTGTCCTCTTG-3’

YkoL-FOR

ykoL

5’- TGAAATGCTGGAGACGTTTATG-3’

YkoL-REV

5’-TTTTCTAAAGCGGATTTCAATA-3’

Белки PhoP-His6 и PhoR-His6 B.subtilis выделяли из цитоплазмы рекомбинантного штамма E.coli, выращенного при 30°С на L-бульоне с добавлением в середине логарифмической фазы роста индуктора ИПТГ (0.5 мМ). Клетки разрушали ультразвуком. Осветленный дезинтеграт клеток наносили на колонку с никель-сефарозой, уравновешенную фосфатным буфером (рН 8.0). Элюцию связавшегося белка проводили в градиенте 20-500 мМ имидазола. Полученный препарат подвергали гель-фильтрации на

сефадексе G-100. Степень чистоты и молекулярный вес белков оценивали с помощью Ds-Na-ПААГ-электрофореза, используя 4%-ый концентрирующий (рН 6.8) и 10%-ый разделяющий (рН 8.8) гели на основе трис-глицинового буфера [Laemmli, 1970].

Масс-спектрометрический анализ очищенных PhoP и PhoR белков проведен на MALDI-TOF масс-спектрометре «Voyager DE-RP» доктором Дж. Греем (лаборатория «Pinnacle», Университет Ньюкасла, Великобритания). Результаты проанализированы с помощью программы «Mascot PMF» (http://www.matrixscience.com).

О ДНК-связывающей активности PhoP белка в отношении промоторов генов гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл судили по изменению электрофоретической подвижности комплекса ДНК–белок – метод EMSA [Allenby et al., 2006].

Способность трансформантов к синтезу РНКазы проверяли по методу Джеффриса. Активность рибонуклеазы РНКазы в культуральной жидкости определяли модифицированным методом Анфинсена по кослоторастворимым продуктам гидролиза РНК [Лещинская с соавт., 1980]. Специфическую активность рассчитывали как отношение общей рибонуклеазной активности к величине биомассы.

Информация о геномах бацилл, нуклеотидных и аминокислотных последовательностях рибонуклеаз и регуляторных белков извлечена из баз данных Виртуального института микробного стресса и выживания «MicrobesOnline» (http://www.microbesonline.org) и Национального центра биотехнологической информации (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/lproks.cgi).

Поиск ортологов регуляторных белков B.subtilis проводили с помощью средств сайта «MicrobesOnline». Филогенетические древа были построены методом ближайшего связывания (neighbour-joining) на основе выровненных с помощью программы «MUSCLE» (http://www.drive5.com/muscle) и отредактированных с помощью программы «GBlocks» (http://molerol.cmima.csic.es/castresana/gblocks_server.html) аминокислотных последовательностей.

Потенциальные сайты для взаимодействия регуляторных белков с промоторами генов рибонуклеаз выявляли с помощью программы «Virtual Footprint» (http://www.prodoric.de/vfp/vfp_promoter.php) и визуально, используя их логотипы, представленные в базах «Prodoric» (http://www.prodoric.de) и «DBTBS» (http://dbtbs.hgc.jp ).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ «Excel 2003». Рассчитывали среднеквадратичное отклонение (), результаты считали достоверными при 10%. При расчете достоверности получаемых разностей использовали t-критерий Стьюдента, принимая Р 0.05 за достоверный уровень значимости.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Ортологи phoP, spo0A и resD генов Bacillus subtilis в секвенированных геномах бацилл.

Известно, что функционирование Pho регулона в условиях дефицита в среде неорганического фосфата контролируется у B.subtilis тремя взаимосвязанными системами [Birkey et al., 1998] - PhoP-PhoR (основная роль в регуляции метаболизма фосфора), ResD-ResE (отвечает за модуляцию процессов аэробного и анаэробного дыхания) и многокомпонентной системой Spo0A-фосфопередачи (инициирует спорообразование). Для того чтобы оценить их роль в регуляции экспрессии генов гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл, на первом этапе работы было необходимо установить, присутствуют ли подобные системы у других представителей рода и насколько они могут быть функционально сходны. Для этого в секвенированных геномах бацилл мы провели поиск ортологов указанных регуляторных систем. Так как у прокариот многие гены являются ксенологами [Lerat et al., 2005; Kunin et al., 2005], было важно оценить вероятность происхождения исследуемых белков в результате горизонтального транспорта генов. Поэтому мы также сравнивали генетический контекст генов [Korbel et al., 2004; Wu et al., 2005] и сопоставляли филогенетические древа бациллярных видов, построенные на основе аминокислотных последовательностей регуляторных белков и гена 16S-рРНК [Price et al., 2007].

Потенциальные ортологи phoP-phoR, resD-resE и spo0A генов B.subtilis были обнаружены у всех бацилл. Генетический контекст phoP-phoR генов бацилл оказался весьма сходным (рис. 1А), в то время как resD-resE и spo0A гены расположены в более вариабельных локусах. Аминокислотные последовательности PhoP белков бацилл были идентичны таковым B.subtilis на 69-88%, PhoR – на 40-71%, ResD - на 73-95%, ResE – на 52-91%, Spo0A - на 75-97%. По степени идентичности аминокислотных последовательностей и сходству организации генетических локусов виды бацилл можно разделить на отдельные группы, преимущественно отражающие филогенетическое родство, что характерно только для истинных ортологов.

В совокупности полученные данные позволяют утверждать, что у различных видов бацилл имеются структурно и функционально сходные PhoP, Spo0A и ResD белки, что позволило нам использовать B.subtilis в качестве модельного организма для изучения регуляции экспрессии генов гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл.

2. Взаимодействие PhoP белка Bacillus subtilis с промоторами генов гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл.

В промоторах генов гуанилспецифичных рибонуклеаз В.intermedius, В.pumilus, B.thuringiensis ранее были обнаружены потенциальные последовательности для связывания PhoP белка B.subtilis и установлено, что

Рисунок 1. Ортологи PhoP белков B.subtilis у различных видов бацилл.

А) Филогенетическое древо, построенное на основе аминокислотных последовательностей PhoP белков бацилл, и генетический контекст кодирующих их генов. Гены phoP-phoR выделены рамкой.

Б) Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей PhoP белков бацилл. Функционально значимые аминокислоты ДНК-связывающего домена отмечены звездочкой.

Рисунок 2. Аффинная хроматография осветленного дезинтеграта клеток E.coli, экспрессировавших PhoP-His6 белок B.subtilis, (А) и DS-Na-ПААГ-электрофорез белковых фракций (Б).

экспрессия их генов в рекомбинантных штаммах B.subtilis является PhoP-PhoR-зависимой [Знаменская с cоавт., 1999, Морозова с соавт., 2001], в то время как синтез рибонуклеазы B.circulans хотя и зависел от содержания фосфора в окружающей среде, но не подчинялся контролю со стороны PhoP-PhoR системы. Чтобы сделать окончательный вывод о непосредственном участии PhoP белка в транскрипции генов рибонуклеаз бацилл, было необходимо экспериментально оценить его способность связываться с их промоторными областями.

Проведенный нами сравнительный анализ первичной структуры PhoP белков B.subtilis, B.amyloliquefaciens, B.pumilus и B.thuringiensis показал, что основные различия сосредоточены в линкерной области, соединяющей N- и С-домены белков, в то время как функционально значимые аминокислотные остатки ДНК-связывающих доменов консервативны (рис. 1Б). Это свидетельствует об универсальности взаимодействия этих регуляторов ответа с ДНК-мишенями, поэтому мы использовали PhoP белок B.subtilis для изучения связывания с промоторами генов гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл методом EMSA.

Получение PhoP и PhoR регуляторных белков B.subtilis. Белки PhoP и PhoR B.subtilis были экспрессированы в индуцибельной Т7-системе, включающей конструкцию на основе pET вектора и штамм-реципиент E.coli BL21(DE3). Для оптимизации синтеза рекомбинантных белков была проведена серия экспериментов, в которой варьировали температуру выращивания продуцента, концентрацию вносимого индуктора и время индукции. Эффективным оказалось выращивание бактерий при температуре 30°С и индукция синтеза целевых белков с помощью 0.5 мМ ИПТГ в течение 3 часов. Эти условия были применены для препаративного выделения белков. В результате очистки с помощью металл-хелатной аффинной хроматографии (рис. 2) и последующей гель-фильтрации были получены электрофоретически гомогенные белки (рис. 3). Проведенный масс-спектрометрический анализ препаратов подтвердил, что они являются именно PhoR и PhoP белками B.subtilis.

Рисунок 3. PhoP и PhoR белки B.subtilis, выделенные из рекомбинантных штаммов E.coli.

Условные обозначения: 1 – неиндуцированная культура; 2-3 – растворимые клеточные фракции, содержащие соответственно PhoR и PhoP белки; 4 – PhoR, 5 - PhoP.

ПЦР-амплификация промоторов генов гуанилспецифичных рибонуклеаз. Для получения регуляторных областей генов РНКаз бацилл была выделена их хромосомная ДНК и проведена амплификация необходимых участков с помощью ПЦР. Принимая во внимание сходство промоторных областей генов рибонуклеаз, для их амплификации были использованы две пары праймеров – одна для биназоподобных РНКаз, а другая - для барназоподобных РНКаз (см. табл.). Так как праймеры не были строго специфичными, потребовалась оптимизация условий проведения ПЦР. Для каждого промотора были подобраны концентрации ДНК-матрицы и ионов магния, а также температура отжига праймеров. Полученные фрагменты были очищены и определена концентрация ДНК в препаратах (рис. 4).

Рисунок 4. Промоторные области генов гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл и гена ykoL B.subtilis, амплифицированные с помощью ПЦР.

Условные обозначения: 1 – B.amyloliquefaciens H2, 2 – B.circulans BCF247, 3 - B.subtilis subsp. subtilis str. 168, 4 – B.intermedius 7P, 5 – B.pumilus KMM62, 6 – B.thuringiensis var. subtoxicus В388.

Анализ изменения электрофоретической подвижности в геле комплекса ДНК–белок. Чтобы доказать непосредственное связывание белка PhoP с промоторами генов рибонуклеаз бацилл, был проведен EMSA-анализ, в котором использовали PhoP белок в активной (фосфорилированной с помощью родственной киназы PhoR) и неактивной формах. Было показано, что регулятор транскрипции PhoP эффективно связывается с промоторами генов РНКаз Вi, Bpu и Bth (рис. 5А), степень взаимодействия зависит от концентрации белка. Фосфорилирование регулятора ответа белком PhoR оказывает незначительное влияние, что объясняется возможным фосфорилированием PhoP с помощью киназ E.coli [Yamamoto et al., 2005; Baek and Lee, 2007]. Промоторы генов РНКаз Ba и Bci не обладали способностью образовывать комплекс с PhoP белком (рис. 5Б).

Рисунок 5. Изменение электрофоретической подвижности комплекса белка PhoP с регуляторными областями генов рибонуклеаз бацилл.

А) Промоторы генов рибонуклеаз B.intermedius, B.pumilus и B.thuringiensis.

Б) Промоторы генов рибонуклеазы B.amyloliquefaciens, ykoL B.subtilis (позитивный контроль) и рибонуклеазы B.circulans.

Таким образом, полученные данные о взаимодействии PhoP белка с промоторами генов биназоподобных рибонуклеаз in vitro в совокупности с более ранними результатами по изучению экспрессии их генов в phoP-phoR мутантных штаммах B.subtilis позволяют отнести внеклеточные рибонуклеазы В.intermedius, B.pumilus и B.thuringiensis к новым членам Pho регулона бацилл. Вместе с тем открытым остался вопрос о механизмах регуляции экспрессии генов других гуанилспецифичных рибонуклеаз – РНКаз B.circulans и B.amyloliquefaciens, промоторы которых не способны взаимодействовать с PhoP белком.

3. Сайты связывания регуляторных белков Pho регулона в промоторах генов рибонуклеаз бацилл.

Для обнаружения нуклеотидных последовательностей, определяющих регуляторные механизмы экспрессии генов гуанилспецифичных рибонуклеаз, был проведен сравнительный анализ их промоторных областей на наличие сайтов взаимодействия с регуляторными белками Spo0A и ResD B.subtilis. В промоторных областях генов РНКаз Ва и Вci было выявлено несколько

Рисунок 6. Потенциальные сайты связывания регуляторных белков Pho регулона в промоторах генов гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл.

А) Spo0A-последовательности. Б) ResD-последовательности.

Условные обозначения: сайты связывания регуляторных белков на «плюс» цепи выделены рамкой, на «минус» цепи – серым цветом; предполагаемые Pho-боксы подчеркнуты одной линией, точка начала транскрипции – дважды; сверху приведены логотипы Spo0А- и ResD-боксов B.subtilis.

нуклеотидных последовательностей, гомологичных 0A-боксу B.subtilis (рис. 6А). Они отличались от консенсусной 1-3 нуклеотидами. Расположение большинства потенциальных 0А-боксов в промоторах генов РНКаз Ba и Bci практически совпадало, хотя в них были отмечены и небольшие различия. В промоторах генов гуанилспецифичных рибонуклеаз В.intermedius, B.pumilus и B.thuringiensis 0А-подобных сайтов B.subtilis, обнаружено не было. Сайты, гомологичные ResD-связывающим последовательностям B.subtilis, были найдены в промоторах генов всех исследуемых РНКаз, однако количество сайтов и их расположение было различно (рис. 6Б). Таким образом, наличие в промоторах генов гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл потенциальных сайтов для связывания регуляторных белков, указывает на возможную роль данных факторов в регуляции транскрипции генов РНКаз.

4. Экспрессия генов гуанилспецифичных рибонуклеаз в нативных и дефектных по регуляторным белкам Pho регулона штаммах Bacillus subtilis.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»