WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

УЛЬЯНОВА Вера Владимировна

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ГУАНИЛСПЕЦИФИЧНЫХ РИБОНУКЛЕАЗ БАЦИЛЛ В УСЛОВИЯХ ФОСФАТНОГО ГОЛОДАНИЯ

03.00.07 – микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Казань – 2009

Работа выполнена на кафедре микробиологии Казанского государственного университета им. В. И. Ульянова-Ленина

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент

Вершинина Валентина Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

старший научный сотрудник

Коксин Владимир Петрович

(РЦПБ СПИД и ИЗ МЗ РТ, г. Казань)

кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник

Морозова Ольга Владимировна

(Институт проблем экологии и недропользования АН РТ, г. Казань)

Ведущая организация:

Казанский институт биохимии и биофизики КНЦ РАН, г. Казань

Защита диссертации состоится «26» ноября 2009 г. в __ часов на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при Казанском государственном университете по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18, главное здание, ауд. 211.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н. И. Лобачевского при Казанском государственном университете.

Автореферат разослан «21» октября 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук З. И.  Абрамова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ферменты нуклеинового обмена в течение многих лет привлекают к себе внимание исследователей в связи с их исключительной ролью в жизни организмов и практической значимостью для человека. Рибонуклеазы выполняют важные функции в метаболизме бактериальных клеток: они не только необходимы для извлечения рибонуклеотидов из окружающей среды и элиминации ненужных внутриклеточных РНК, но и участвуют в контроле экспрессии генов путем изменения стабильности различных видов РНК. Кроме того, секретируемые рибонуклеазы могут являться для их продуцентов эффективным средством в конкурентной борьбе с другими микроорганизмами за экологическую нишу.

Рибонуклеазы применяются в генной инженерии, молекулярной биологии и биотехнологии для удаления РНК из биологического материала, структурно-функциональных исследований нуклеиновых кислот и их комплексов с белками, разработке векторов для позитивной селекции рекомбинантов, получения стерильных трансгенных растений. Перспективным прикладным аспектом использования микробных РНКаз является медицинский. Области их возможного применения связаны с лечением опухолей и вирусных инфекций.

Внеклеточные гуанилспецифичные рибонуклеазы обнаружены у многих видов бацилл, в том числе у Bacillus amyloliquefaciens, B.circulans (барназоподобные РНКазы), В.intermedius, В.pumilus, B.thuringiensis (биназоподобные РНКазы). Ферменты сходны по первичной структуре, близки по физико-химическим и каталитическим свойствам. Однако исследование биосинтеза рибонуклеаз выявило значительные различия в условиях, при которых происходит их накопление в среде, что оставляет открытым вопрос о назначении этих ферментов.

Клонирование и секвенирование генов гуанилспецифичных РНКаз открыло возможность для изучения регуляции их синтеза на уровне транскрипции. Выявление регуляторных механизмов, отвечающих за экспрессию генов в тех или иных условиях, является одной из глобальных проблем молекулярной биологии. Бактерии способны активировать синтез определенных продуктов только в специфической экологической обстановке, либо репрессировать его, если образуемые белки препятствуют другим процессам, протекающим в данный момент в клетке. Регуляция экспрессии генов может также осуществляться как часть процесса дифференцировки и развития клеточной популяции. Информация о путях контроля экспрессии гена важна не только для установления функции кодируемого им белка, но и необходима для осуществления направленного воздействия на геном микроорганизма с целью увеличения выхода желаемого продукта.

Таким образом, знание молекулярных механизмов регуляции синтеза рибонуклеаз позволит создать фундамент для их эффективного использования в прикладных сферах и будет способствовать решению ряда общебиологических проблем, связанных с ролью этих ферментов в основных физиологических процессах клетки.

Целью настоящего исследования явилось выяснение механизмов регуляции экспрессии генов гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл в условиях фосфатного голодания.

В работе решались следующие задачи:

1. Провести поиск у различных видов бацилл ортологов phoP, spo0A и resD генов B.subtilis, продукты которых контролируют специфический ответ на фосфатное голодание.

2. Исследовать взаимодействие фактора транскрипции PhoP B.subtilis с регуляторными областями генов гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл.

3. Определить потенциальные сайты связывания Spo0A и ResD белков в промоторах генов бациллярных рибонуклеаз.

4. Изучить экспрессию генов гуанилспецифичных рибонуклеаз в нативных и дефектных по регуляторным белкам Pho регулона штаммах B.subtilis.

Положения, выносимые на защиту:

  1. Регулятор транскрипции PhoP B.subtilis - типичный представитель семейства гомологичных белков, контролирующих Pho ответ у различных видов бацилл, может быть использован в качестве модельного белка для изучения связывания с промоторами генов гуанилспецифичных рибонуклеаз.
  2. Специфическое взаимодействие белка PhoP с промоторами генов рибонуклеаз В.intermedius, В.pumilus, B.thuringiensis позволяет отнести их к новым членам Pho регулона, функционирующего у бацилл в условиях фосфатного голодания.
  3. Наличие в промоторах генов гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл потенциальных сайтов связывания регуляторных белков ResD и Spo0A и изменение уровня ферментативной активности в соответствующих мутантных штаммах свидетельствует о роли этих белков в экспрессии генов исследуемых РНКаз.

Научная новизна работы. Анализ распространенности среди бацилл двухкомпонентных систем трансдукции сигнала PhoP-PhoR, ResD-ResE и многокомпонентной системы Spo0A-фосфопередачи, контролирующих Pho ответ B.subtilis, выявил высокую консервативность регуляторов ответа и видовые особенности, присущие гистидин киназам. Впервые показано непосредственное связывание основного регулятора Pho ответа бацилл – белка PhoP с промоторами генов рибонуклеаз В.intermedius, В.pumilus, B.thuringiensis, что на молекулярном уровне подтверждает его участие в контроле транскрипции их генов. Кроме того, в регуляторных областях генов рибонуклеаз охарактеризованы потенциальные сайты связывания для Spo0A и ResD белков и получены приоритетные данные об участии данных факторов транскрипции в регуляции экспрессии генов гуанилспецифичных РНКаз.

Практическая ценность работы. Полученные в работе данные о механизмах контроля синтеза внеклеточных рибонуклеаз бацилл могут быть использованы при конструировании экспрессионных систем с целью получения высокоэффективных промышленных штаммов-продуцентов целевых белков. Подобные системы должны включать ген целевого белка под контролем промотора биназоподобной рибонуклеазы и бациллярный штамм-хозяина для его экспрессии, дефектный по негативному регулятору Spo0A. В частности этот подход позволил нам получить суперпродуцент рибонуклеазы В.intermedius, обладающей противоопухолевой и противовирусной активностью. Кроме того, выявленные в работе закономерности важны для общего понимания механизмов функционирования регуляторных систем бациллярной клетки и могут быть использованы в учебном процессе в соответствующих курсах лекций и семинарах для студентов-биологов.

Связь работы с научными программами. Исследования проводились в соответствии с планом НИР КГУ (№ гос. регистрации 01.2.006.09683 «Механизмы функциональной активности клетки») и были выполнены при финансовой поддержке ФЦНТП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники" (Госконтракты 02.434.11.3020, 02.512.11.2050 и 02.512.12.2014), гранта РФФИ 05-04-48182, гранта Правительства Республики Татарстан (2008 г.), программы Международного союза микробиологических сообществ «UNESCO-IUMS-SGM Fellowship».

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на XIII Международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение» (Казань, 2005); V Республиканской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Наука. Инновации. Бизнес» (Казань, 2005); Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005); 10-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых, посвященной 50-летию Пущинского научного центра РАН, «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2006); I Международной научно-практической конференции «Микробная биотехнология – новые подходы и решения» (Казань, 2007); XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2007); I Всероссийском, с международным участием, конгрессе студентов и аспирантов биологов «Симбиоз Россия 2008» (Казань, 2008); Первой межуниверситетской конференции по современной биологии «Bionews» (Kazan, 2008); XIV Международной конференции, посвященной 20-летию партнерства между Казанским государственным университетом и Гиссенским университетом им. Ю. Либиха, «Microbial enzymes in biotechnology and medicine» (Kazan, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность профессору Колину Харвуду (Университет Ньюкасла, Великобритания) за предоставленную возможность проведения на базе его лаборатории экспериментов по изучению взаимодействия PhoP белка B.subtilis с регуляторными областями генов гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл; профессору Мичико Накано (Университет здоровья и науки Орегона, США) за предоставленные для работы resD-resE мутантные штаммы, а также сердечно благодарит научного руководителя к.б.н., доцента Вершинину Валентину Ивановну за внимательное отношение к работе и всех коллег НИЛ биосинтеза и биоинженерии ферментов кафедры микробиологии КГУ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов исследования, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 218 источника, из них 186 зарубежных, и приложений. Работа изложена на 138 страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц и 27 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Штаммы бактерий. Escherichia coli BL21 DE3 (F– ompT gal dcm lon hsdSB (rB- mB-) DE3 (lacI lacUV5-T7 ind1 sam7 nin5)), предоставленный проф. К. Харвудом (Университет Ньюкасла, Великобритания) был использован для продукции PhoP и PhoR белков B.subtilis; B.amyloliquefaciens Н2 (проф. Р. Хартли, Национальные институты здоровья, США), B.circulans BCF247 и B.thuringiensis var. subtoxicus В388 (Центр “Биоинженерия” РАН), B.intermedius 7P (Всероссийская коллекция промышленных организмов), B.pumilus KMM62 (ТИБОХ ДВО РАН) - для получения промоторных областей генов гуанилспецифичных рибонуклеаз. Роль регуляторных белков в контроле экспрессии генов РНКаз изучали в штаммах B.subtilis: JH642 (pheAl trpC2), JH646 (pheA1 trpC2 spo0A12), JH647 (pheA1 trpC2 spo0E11) и R15-13 (pheA1 trpC2 abrB23 spo0A12), полученных из Бациллярного генетического стокового центра (Государственный университет Охайо, США); LAB2506 (trpC2 pheA1 resD::cat) и LAB2234 (trpC2 pheA1 resE::spc), предоставленных проф. М. Накано (Университет здоровья и науки Орегона, США).

Плазмиды pET-PhoP и pET-PhoR231 предназначены для получения белка PhoP и цитоплазматического фрагмента белка PhoR B.subtilis в клетках E.coli (проф. К. Харвуд, Университет Ньюкасла, Великобритания); pMZ55, pMZ56, pMZ58, pMZ59 и pMT420 - для экспрессии генов гуанилспецифичных рибонуклеаз B.intermedius (биназа, РНКаза Bi), B.pumilus (РНКаза Bpu), B.thuringiensis (РНКаза Bth), B.circulans (РНКаза Bci) и B.amyloliquefaciens (барназа, РНКаза Ba) соответственно в штаммах B.subtilis (коллекция НИЛ биосинтеза и биоинженерии ферментов КГУ).

Бактерии культивировали на L-бульоне либо бесфосфорной синтетической среде (содержание Фн - 4 мкг/мл) при 37°С с аэрацией. Контроль роста культуры производили путем измерения оптической плотности суспензии при длине волны 590 нм. При необходимости в среды добавляли соответствующие антибиотики: канамицин (10 мкг/мл), спектиномицин (75 мкг/мл), хлорамфеникол (5 мкг/мл – для штамма B.subtilis LAB2506 и 10 мкг/мл – для штаммов, несущих плазмиду pMT420), ампициллин (100 мкг/мл), а для ауксотрофных штаммов - фенилаланин и триптофан (50 мкг/мл).

Выделение хромосомной ДНК из клеток В.subtilis осуществляли с помощью набора реактивов «DNeasy Blood & Tissue Kit» («Qiagen»). Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli и В.subtilis, рестрикцию плазмид, электрофорез ДНК в агарозном геле, а также трансформацию плазмидами компетентных клеток E.coli и B.subtilis проводили стандартными методами [Sambrook and Russell, 2001].

Промоторные области генов рибонуклеаз бацилл и гена ykoL B.subtilis (позитивный контроль для EMSA анализа) амплифицировали в программируемом термостате «Techne TC-512» в реакционной смеси с Platinum Pfx-полимеразой («Invitrogen»), хромосомной ДНК соответствующих видов бацилл и праймерами, представленными в таблице. Состав реакции и условия проведения ПЦР, оптимальные для каждой пары праймер-матрица, подобраны в данной работе. Очистку ПЦР-продуктов проводили с помощью китов «QIAquick PCR Purification Kit» или «QIAquick Gel Extraction Kit» («Qiаgen»).

Таблица

Праймеры для амплификации регуляторных областей генов гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл и гена ykoL B.subtilis

Праймеры

Промоторы генов для амплификации

Последовательность

FBaR

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»