WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

Ганеева Лилия Ахатовна

ОЦЕНКА УРОВНЯ АНТИОКИСЛИТЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ И ЖЕЛЕЗА, МЕДИ, МАРГАНЦА В КЛЕТКАХ КАРТОФЕЛЯ, ИНФИЦИРОВАННЫХ PHYTOPHTHORA INFESTANS.

03.00.07 – микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Казань - 2009

Работа выполнена в ТТГПУ, г. Казань и в Институте проблем экологии и недропользования академии наук РТ, г.Казань.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Морозов Николай Васильевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Филимонова Мария Николаевна

доктор биологических наук,

профессор Чиков Владимир Иванович

Ведущая организация: Татарский НИИ агрохимии и почвоведения Российской сельскохозяйственной академии, г. Казань.

Защита состоится 24 сентября 2009 г. В 13. 00 часов на заседании диссертационного Совета Д.212.081.08. при Казанском государственном университете по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д.18

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского государственного университета

Автореферат разослан «20» августа 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного Совета

доктор биологических наук, профессор З.И. Абрамова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Фитофтороз, вызываемый оомицетом Phytophthora infestans (Mont.) de Bary – самое вредоносное заболевание картофеля в большинстве стран мира. Ежегодные общие потери этой культуры от заболевания и затраты на борьбу с ним стремительно растут и недавно оценивались примерно в 3 млрд. долларов (Захаренко В.А., 2003).

В начале ХХІ столетия была зафиксирована очередная волна резкого возрастания вредоносности фитофтороза. Серьезные изменения в биологии возбудителя заболевания в итоге привели к повышению его экологической пластичности, адаптивности и усилению патогенных свойств.

Возросший эпифитотиологический потенциал P. Infestans стал причиной снижения эффективности традиционных методов защиты картофеля, и агротехнические мероприятия в настоящее время имеют скорее профилактическое значение. Считается также, что возделывание устойчивых сортов картофеля не гарантирует получения стабильного урожая в условиях сильного развития болезни без применения фунгицидов.

Однако и химический метод может обеспечить приемлемый уровень контроля заболевания, но только при условии увеличения количества обработок. Так, в странах ЕС посадки картофеля опрыскивают 7–20 раз за сезон, что на 40% выше, чем в 70-х годах (Филиппов А.В., 2005). Дополнительные затраты на пестициды снижают рентабельность выращивания культуры, вызывают обеспокоенность потребителей картофеля, отдающих предпочтение экологически чистой продукции, и усиливают антропогенный прессинг на окружающую среду. Современная концепция интегрированной защиты картофеля ориентирована на использование, как химических, так и нехимических (организационно-хозяйственных, агротехнических и биологических) методов.

Альтернативой применению пестицидов являются биологические методы защиты растений, в первую очередь те методы и приемы, которые индуцируют устойчивость растений к патогену.

Устойчивость растения к патогену определяется способностью распознать и своевременно включить механизм защиты. Наряду с индукцией синтеза фитоалексинов и гидролитических ферментов, к таким механизмам относится активация в инфицированных клетках и клетках, локализованных вблизи очага инфекции, программы собственной гибели - процесс, называемый гиперчувствительным ответом (ГО). Образуется зона мертвых обезвоженных клеток, которая служит барьером для дальнейшего распространения патогена. Установлено, что при ГО гибель клеток растений вызывается не прямым деструктивным действием патогена, а активацией им генетической программы гибели растительной клетки. Процесс сопровождается дыхательным взрывом - генерацией H2О2 при участии NADPH-оксидазы цитоплазматической мембраны (Tada Y. et al., 2001).

При этом перекись водорода в малых концентрациях является индуктором апоптоза, а в высоких концентрациях вызывает некроз - быструю гибель клеток, без каких-либо морфологических изменений, характерных для апоптоза(Apel K., Hirt H., 2004).

В настоящее время имеются убедительные свидетельства, что в реализации неспецифической устойчивости растений принимают участие активные формы кислорода и противостоящая им система антиоксидантной системы защиты. В частности, показано, что ингибирование системы антиоксидантной защиты (АОЗ) способно увеличить устойчивость картофеля к фитофторозу (Еланский С.Н., Попова И.И., 1998). Каталаза и пероксидаза являются ферментами, участвующими в деградации H2О2. При этом ключевую роль в реализации и направленности окислительно-восстановительных реакций, осуществляемыми этими ферментами, играют «переходные» металлы (металлы с переменной валентностью) (Ребров В.Г., Громова О.А., 1989; Сусликов В.Л., 2000).

Но, если влияние активности антиоксидантных ферментов, в частности каталазы, на формирование устойчивости и восприимчивости картофеля к фитофторе установлено (Панина Я.С. и др., 2004), то работы о характере влияния ионов железа, меди и марганца на эти процессы практически отсутствуют.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: выявление уровня активности каталазы и пероксидазы и сопряженного с этим обмена железа, меди и марганца в картофеле, инфицированном двумя, отличающимися по агрессивности расами Phytophthora infestans (Mont.) de Bary и сопоставление этой активности с процессом формирования устойчивости или восприимчивости картофеля.

Задачи исследования:

1. Определить характер изменения активности каталазы и пероксидазы в клубнях картофеля при его инфицировании исходной (первичный полевой изолят) и агрессивной расами фитофторы.

2. Определить содержание железа, меди, марганца в клубнях картофеля, инфицированных исходной и агрессивной расами фитофторы.

3. Определить содержание железа, меди и марганца в зооспорангиях исходной и агрессивной рас фитофторы.

4. Оценить содержание железа, меди и марганца в почвах промышленного выращивания картофеля.

5. Исследовать характер влияния марганца на активность каталазы и пероксидазы в клетках картофеля, инфицированных фитофторой.

6. Определить возможность индуцирования устойчивости картофеля к фитофторозу обработкой растений в период вегетации соединениями марганца.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.

Впервые показан характер изменения активности каталазы и пероксидазы - основных ферментов, регулирующих содержание внутриклеточной перекиси водорода при инфицировании клеток картофеля расами фитофторы, отличающимися агрессивностью. Выявлена корреляция между агрессивностью патогена, изменением активности двух антиоксидантных ферментов, содержанием железа, меди и марганца.

Показано в системах in vivo и in vitro, что восстановление баланса «Fe / Mn» индуцирует устойчивость картофеля к инфицированию фитофторой.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РЕЗУЛЬТАТОВ.

В проведенных полевых опытах было установлено, что опрыскивание растений в период вегетации растворами, содержащими марганец (особенно в форме сукцината марганца), индуцирует устойчивость клубней картофеля к инфицированию фитофторой.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Инфицирование клеток клубней картофеля двумя расами фитофторы индуцирует повышение активности каталазы и пероксидазы, и тем в большей степени, чем выше агрессивность патогена.

2. Содержание железа в инфицированных двумя расами фитофторы, клетках клубней картофеля выше, чем в интактных клетках, и возрастание содержания этого микроэлемента зависит от агрессивности расы патогена и коррелирует с нарастанием активности антиоксидантных ферментов.

3. Высокое содержание железа в зооспорангиях, возможно, является одним из механизмов подавления защитной системы растительных клеток фитофторой.

4. Восполнение дефицита марганца в почве путем опрыскивания растений в период вегетации растворами, содержащими марганец, повышает устойчивость картофеля к фитофторе.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Материалы диссертации докладывались и обсуждались на: «Научно-практической конференции, посвященной 70-летию кафедры химии ТГГПУ», 2007 год; «Экологической конференции Поволжья», 2008 год.

ПУБЛИКАЦИИ.

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 3 в рекомендованных ВАК для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата наук.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертация общим объемом в 118 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, обсуждения, заключения, выводов, приложения; иллюстрирована 15 таблицами и 14 рисунками. Список литературы включает 140 наименований, в том числе 73 зарубежные публикации.

Содержание работы


Материалы и методы исследования

Объектом исследований служили изолят Phytophthora infestans, клубни картофеля сорта «Невский», а также образцы почвы. Все эти объекты были собраны и получены в хозяйствах Нижнекамского района Республики Татарстан.

Выделение возбудителя из пораженной ботвы проводили на ломтиках свеженарезанных клубней того же сорта картофеля (Шемякина В.П. и др., 1997).

Изолят P. Infestans, условно обозначенный «исходной» расой патогена, был выращен на агаризованной овсяной среде (Поединок Н.Л., Дьяков Ю.Т., 1981).

Для наращивания агрессивности патогена использовали газон из листьев картофеля применяя метод, разработанный во ВНИИ фитопатологии (Filippov, A. V., Kuznetzova, M. A. et al., 2000). В общей сложности было проведено 5 пассажей патогена.

В экспериментах использовали клубни того же сорта картофеля, из которого был выделен патоген, и листья которого использовались для наращивания агрессивности.

Определения ферментативной активности, индекса агрессивности патогена и содержания микроэлементов проводили в брусочках картофеля, размером 7x10x30 мм, инфицированных исходной и агрессивной расами фитофторы. Контролем служили аналогичные брусочки картофеля, смоченные в том же растворе, на котором готовили суспензию зооспор. Каждый вариант опыта был представлен 20 образцами.

Процедура инфицирования: брусочки картофеля одной гранью (10х30 мм) на 3-5 секунд погружали в суспензию зооспорангиев (концентрация 108 в мл), разлитую слоем в 2-3 мм в чашки Петри. Инкубацию брусочков проводили при комнатной температуре (18-23° С) в перекрытых чашках Петри. Инфицированная грань брусочка была обращена вверх.

Через 6 суток измеряли длину зоны поражения и определяли интенсивность спороношения по пятибалльной шкале: 0 – спороношение отсутствует, 5 – спороношение по всей поверхности пораженной зоны, 1-4 – промежуточные значения.

Индекс агрессивности патогена вычисляли по формуле:

X = (Ii·Di) / n,

где Ii – средняя величина поражения, мм; Di – средняя интенсивность спороношения, балл; n - количество заражений (Лаврова О.И., и др., 2003).

Для определения активности антиоксидантных ферментов и содержания микроэлементов с граней брусочков, которые были инфицированы, срезали слой ткани высотой в 2-3 мм. В этих срезанных частях и проводились указанные выше определения. С контрольных брусочков также срезали слой, обращенный вверх.

Активность каталазы определяли по Баху А.Н. и Опарину А.М. (Тенишева Н.Х., 2003).

Активность пероксидазы определяли в кинетической реакции с ферроцианидом калия (Рогожкин В.В., 2006).

Пробы, для определения содержания железа, марганца и меди в клубнях картофеля готовили следующим образом: навески весом 5 г смачивались концентрированной азотной кислотой, помещались в фарфоровые тигли, которые устанавливали в холодную муфельную печь. Температуру муфельной печи постепенно (в течении 2 ч.) поднимали до 450о С и выдерживали при этой температуре до полного озоления образца (~8 ч.). Золу растворяли в 50 мл 1 N азотной кислоте, отфильтровывали через беззольный фильтр. Фильтрат доводили в мерной колбе до 50 мл.

Содержание железа, марганца и меди определяли методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии на спектрофотометре AAS-3. Определение проводили в окислительном воздушно-ацетиленовом пламени: железа - при длине волны 248.3 нм, марганца – 279.5 нм, меди - 324.8 нм, (Хавезов И., Цалев Д., 1983; Прайс В., 1976; Славин У.В., 1971).

Концентрации металлов пересчитывались в мкг/г сырой растительной ткани по формуле:

С = (А·50)/m,

Где С – концентрация металла в образце, мкг/г; А – показания прибора, мкг/мл; 50 – объем аликвоты, мл; m – навеска, г.

Содержание металлов в суспензии зооспорангиев определяли следующим образом: раствор суспензии зооспорангиев объемом 100 мл выпаривали на водяной бане, сухой остаток ресуспендировал в 5 мл концентрированной азотной кислоты и кипятили в течение 10 мин. Затем раствор доводили дистиллированной водой до 10 мл и анализировали. Результаты пересчитывали по формуле:

C = (A·10)/100,

где С – концентрация металла в суспензии, мкг/мл; А – показания прибора, мкг/мл; 10 – объем аликвотной части, мл; 100 – объем пробы, мл.

Отбор почвы осуществлялся методом «конверта», с 5 точек на расстоянии 3 м друг от друга. Образцы высушивали до воздушно-сухого состояния, растирали в фарфоровой ступке, просеивали через сито d 1 мм, корни и примеси в виде камней при этом удалялись. С разных участков поля было отобрано 10 подобных «конвертов».

Подготовка проб: на аналитических весах отбиралась навеска почвы в 2 грамма, к которой добавляли 10 мл 5 N азотной кислоты. Суспензию выдерживали 3 ч в кипящей водяной бане. Раствор фильтровали и доводили дистиллированной водой до объема 50 мл и анализировали. Результаты рассчитывали по формуле:

С = (А·50)/m,

где С – концентрация металла в образце, мкг/г; А – показания прибора, мкг/мл; 50 – объем аликвоты, мл; m – навеска, г.

Влияние марганца на резистентность растительных клеток к фитофторе изучали с использованием трех соединений этого элемента: сульфата марганца, комплекса марганец-ЭДТА (ООО «Агрохимснаб», Россия), сукцината марганца (Universal Nutrition, США). Во всех экспериментах использовали растворы указанных соединений с равной концентрацией по марганцу - 0.7 мкМ.

В опытах in vitro брусочки картофеля размером 7х10х30 мм перед инфицированием фитофторой выдерживали в растворах, содержащих марганец, 2 часа. Контролем служили брусочки, выдержанные в дистиллированной воде.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»