WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 |

На правах рукописи

ЗАВОДИЛЕНКО КОНСТАНТИН ВЛАДИМИРОВИЧ

КЛЕТОЧНОЕ ОБНОВЛЕНИЕ

В ОЧАГАХ КИШЕЧНОЙ МЕТАПЛАЗИИ

СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДКА

ПРИ АТРОФИИ И ЭРОЗИВНО-ЯЗВЕННЫХ ПОРАЖЕНИЯХ

(биопсийное исследование)

14.00.15 –патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Омск – 2006

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Омская государственная медицинская академия Росздрава»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Кононов Алексей Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Агеева Татьяна Августовна

доктор медицинских наук, профессор Фрейнд Генриетта Герхардовна

Ведущая организация: Государственное учреждение «Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН» (Новосибирск)

Защита диссертации состоится «__31__» _октября__2006 г. в _10_ часов на заседании диссертационного совета Д 208.065.04 при Омской государственной медицинской академии по адресу: 644099, Омск, ул. Ленина, 12; тел.(3812)-23-13-32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Омская государственная медицинская академия Росздрава»

Автореферат разослан «_26__» ___сентября____2006 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук Е.А.Потрохова

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

КМ – кишечная метаплазия

НР – Helicobacter pylori

СОЖ – слизистая оболочка желудка

ЭЯД – эрозивно-язвенный дефект

ИП – индекс пролиферации

ИА – индекс апоптоза

НПВС – нестероидные противовоспалительные средства

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

В современной литературе существуют лишь единичные публикации, рассматривающие в рамках гипотезы причины и механизмы развития КМ желудочного эпителия, и практически единым мнением разных исследователей является положение о том, что она возникает вследствие нарушений дифференцировки эпителиоцитов после повреждения эпителиального пласта [Faller G., Kirchner T., 2005; Jass J.R., Filipe M.I., 1980; Jass J.R., Walsh M.D., 2001]. Существует ряд работ, посвященных изучению клеточной кинетики в очагах кишечной метаплазии, но представленные данные неоднородны и даже противоречивы у разных авторов [Leung W.K. et al., 2001; Leung W.K., Sung J.J., 2002; Guarner J. et al., 2005; Shiotani A. et al., 2005; Faller G., Kirchner T., 2005; Jung J.T. et al., 2005]. Предраковый потенциал КМ в многочисленных исследованиях также неоднозначно оценивается различными авторами: от несомненного предракового изменения [Correa P., 1988], до параканкрозного процесса, идущего параллельно опухолевой трансформации [El-Zimaity H.M.T. et al., 2001; Jass J.R., Walsh M.D., 2001]. Это можно связать с разнородностью самого феномена метаплазии (2 типа и 5 подтипов, выделяемых на основании гистохимического фенотипа [Fillipe M.I., 1989; Jass J.R., Filipe M.I., 1980; Jass J. R., 2001], а также разнообразием фоновых процессов - атрофия желез, эрозивно-язвенный дефект, НР - колонизация, гастропатия, обусловленная приемом НПВС.

Цель исследования. Оценить особенности параметров клеточного обновления в очагах кишечной метаплазии слизистой оболочки желудка в зависимости от наличия атрофии или эрозивно-язвенного дефекта.

Задачи исследования.

  1. Изучить особенности пролиферации и апоптоза метаплазированного эпителия при различных типах кишечной метаплазии слизистой оболочки желудка по сравнению с неметаплазированным эпителием в условиях эрозивно-язвенного дефекта.
  2. Изучить особенности пролиферации и апоптоза метаплазированного эпителия при различных типах кишечной метаплазии слизистой оболочки желудка по сравнению с неметаплазированным эпителием в условиях атрофии.
  3. Оценить косвенный маркер генетического повреждения (по экспрессии Р53) в метаплазированном эпителии при полной и неполной кишечной метаплазии слизистой оболочки желудка по сравнению с неметаплазированным эпителием в условиях атрофии и эрозивно-язвенного дефекта.

Научная новизна.

Установлены тенденции и закономерности клеточного обновления в очагах различных типов кишечной метаплазии в зависимости от фонового состояния слизистой оболочки желудка.

Практическая значимость.

Оценка клеточного обновления с точки зрения баланса пролиферации и апоптоза может рассматриваться как одна из базисных основ терапевтической стратегии будущего. Результаты исследования дают возможность разработать морфологический прогноз эволюции патологических изменений слизистой оболочки желудка и тактику курации больных с феноменом кишечной метаплазии слизистой оболочки желудка.

Положения, выносимые на защиту.

  1. В условиях эрозивно-язвенного дефекта эпителий в очагах полной кишечной метаплазии не отличается от окружающего неметаплазированного по основным показателям клеточного обновления, тогда как в очагах неполной кишечной метаплазии (типы II и III) наблюдается снижение регенераторного потенциала (снижение пролиферации).
  2. В условиях атрофии слизистой оболочки желудка эпителий в очагах полной кишечной метаплазии отличается повышенной пролиферативной активностью, и поэтому способен к преимущественному замещению убывающего неметаплазированного эпителия. В очагах неполной кишечной метаплазии повышенная пролиферации в сочетании со снижением апоптоза и появлением маркера генетического повреждения (белка Р53) свидетельствует о появлении биологических предпосылок злокачественной трансформации метаплазированного эпителия. Причем при III типе эти предпосылки более выражены, чем при II.

Апробация.

Результаты исследования доложены и представлены на I Всероссийской научно-практической конференции патологоанатомов (Орел, 2005); VI Восточно-Сибирской гастроэнтерологической конференции с международным участием (Красноярск, 2006); II Съезде Российского общества патологоанатомов (Москва, 2006).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Объем и структура.

Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц, иллюстрирована 50 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, глав, посвященных материалам и методам исследования, результатам и обсуждению исследования, выводов и списка литературы (23 отечественных и 93 зарубежных источника).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом послужили 228 гастробиоптатов, полученных при фиброгастроскопии от 81 больного. Критерии включения: возраст от 20 до 45 лет, наличие информированного согласия пациента на участие в исследовании. Критерии исключения: наличие неоплазии (дисплазии) эпителия СОЖ высокой степени, наличие гистологически подтвержденной карциномы слизистой оболочки желудка.

После гистологической верификации состояния слизистой оболочки желудка с кишечной метаплазией в зависимости от наличия атрофии или эрозивно-язвенного дефекта у пациентов они были разделены на 2 группы:

  1. панатрофический гастрит (с атрофией желез и в теле, и в антральном отделе) - 39 пациентов (29 мужчин и 10 женщин);
  2. эрозивно-язвенный дефект слизистой оболочки желудка тела и антрального отдела, ассоциированный с НР-инфекцией – 42 пациента (35 мужчин и 7 женщин);

Гистологическое исследование. Полученные при биопсии фрагменты слизистой оболочки фиксировали в 10%-ном нейтральном забуференном формалине (рН 7,2 – 7,4) в течение 12 - 24 часов, заливали в парафин по общепринятой методике. Парафиновые срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Для оценки морфологических изменений слизистой оболочки желудка использовали разработанную на основе Сиднейской системы классификации хронического гастрита [Price A.B., 1991] визуально-аналоговую шкалу для полуколичественного определения выраженности воспаления, активности процесса, наличия атрофии, кишечной метаплазии и степени обсемененности НР [Dixon M.F., 1996]. В качестве градации использовались обозначения: 0 – отсутствие признака; 1 – слабая степень выраженности признака; 2 – умеренная; 3 – выраженная.

Для идентификации НР-инфекции использовали гистобактериоскопию по методу Гимзы путем приготовления красителя по классической прописи при соотношении компонентов: азур I – 3,772 г., эозин – 2,165 г., метиленовый синий – 1,563 г., абсолютный спирт – 750 мл, глицерин – 256 мл с последующим разведением 1:4 и окрашиванием срезов в течение 40 минут.

Гистохимическое исследование. Для определения профиля муцинов и типирования очагов кишечной метаплазии в клетках слизистой оболочки желудка использовались реакции с 1%-ным альциановым синим при рН=2,5 (кислые сиаломуцины), окраска альдегид-фуксином по Гомори (GAF-метод) (сульфомуцины) [Shan K.A., 1997], ШИК-реакция на основе стандартной методики с основным фуксином [Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996]. Также применялась комбинация методов: альциановый синий (рН=2,5) + GAF-метод, альциановый синий (рН=2,5) + ШИК, поскольку по данным ряда авторов именно такая комбинация методов дает наиболее оптимальную гистохимическую верификацию участков кишечной метаплазии в слизистой оболочке желудка и обеспечивает дифференцирование ее вариантов [Аруин Л.И. и др., 1998; Мозговой С.И. и др., 2004].

При верифицировании типов метаплазии по этому принципу опирались на наиболее подробную классификацию, предложенную Jass J.R. и Filipe M.I. в модификации Ming S.-C. [Ming S.-C., 1998]. Согласно ей, для верифицирования гистохимического подтипа кишечной метаплазии ведущая роль отводится определению доминирующего профиля муцинов в столбчатых эпителиоцитах, расположенных между бокаловидными клетками, и определению признаков специализации (появление щеточной каемки). Кислые сиаломуцины определялись при окрашивании альциановым синим при рН=2,5 (маркер тонкокишечной метаплазии), сульфатированные при окраске альдегид-фуксином по Гомори (маркер толстокишечной метаплазии) [Shan K.A., 1997; Мозговой С.И., 2004], нейтральные при ШИК-реакции (неполная метаплазия желудочного типа).

Для обзорного изучения отдельных гастробиоптатов использовали метод, предложенный В.А.Самсоновым [Самсонов В.А., 1973] в виде сочетания ШИК-реакции с красителем Гимзы (разведение 1:20, окраска в течение 5-10 минут под контролем микроскопа).

Иммуногистохимическое исследование выполняли на парафиновых срезах с применением стрептавидин–биотинового метода (“DAKO”, Дания, LSAB2 Systems, HRP). Демаскировку антигена проводили в цитратном буфере (рН=6,0) в бытовой СВЧ-печи «SAMSUNG–M1774R» с использованием следующего режима мощности: 5 минут – 850Вт, 1 мин. – перерыв, 2 мин. – 850Вт, 1 мин. – 300Вт, 2 мин. – 850Вт, 4 мин. - 300Вт, который варьировался в зависимости от времени закипания. В качестве первичных антител использовали мышиные моноклональные антитела: Ki-67, клон MIB-1 (“DAKO”, Дания); CPP-32 (каспаза-3), клон JHM62 (“Novocastra”, Великобритания); Р53, клон DO-7 (“DAKO”, Дания). Для моноклональных антител к каспазе-3 использовали разведение 1:25, согласно рекомендациям фирмы-производителя. Остальные первичные антитела имели маркировку «готово к применению» («ready to use») и разведение не проводилось. Биотилинированные антитела второго слоя и стрептавидин, меченый пероксидазой входили в систему визуализации “LSAB2 Systems, HRP” (“DAKO”, Дания). В качестве хромогена использовался 3,3-диаминобензидина тетрахлорид, входящий в коммерческий набор детекции указанный выше. Ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера в течении 30 секунд – 2 минут.

В препаратах при 400-кратном увеличении микроскопа определяли индекс пролиферации (ИП) (ядерная метка Ki-67) как долю (в %) положительно окрашенных ядер эпителиоцитов слизистой оболочки желудка в пределах пролиферативного компартмента (где обнаруживалась метка) в 5-ти случайно выбранных полях зрения (500 клеток).

Индекс апоптоза (ИА) (перинуклеарная или цитоплазматическая метка СРР32 - caspase-3) определялся как процент положительно окрашенных эпителиоцитов в 10-ти случайно выбранных полях зрения (1000 клеток), поскольку «зоны апоптоза» в слизистой оболочке желудка расположена более вариабельно, чем зона пролиферации.

Аналогичным образом, что и индекс апоптоза определялся индекс метки Р53 – маркера генетического повреждения (индуктор апоптоза).

Просмотр и фотографирование микропрепаратов осуществляли на микроскопе Nikon Eclipse 400 фирмы Nikon с использованием цифрового фотоаппарата Nikon CoolPix 4500 фирмы Nikon.

Статистические методы. Распределение не соответствовало критериям нормального. Для ориентировочной характеристики выборок использовалось представление данных в виде межквартильных интервалов, что более обосновано для описания распределений с небольшой выборкой. Для расчета достоверности различий применялись непараметрические критерии, позволяющие обойтись без предположения о каком-либо распределении и имеющие вместе с тем высокую степень чувствительности. В частности, для проверки нулевой гипотезы об отсутствия разницы между генеральными параметрами, оцениваемым по выборочным показателям использовался непараметрический Т-критерий Манна-Уитни [Лакин Г.Ф., 1980]. За статистически достоверную разницу принимали значение р<0,05. Также между различными параметрами одной выборки рассчитывался коэффициент корреляции рангов Спирмена () и критерий его достоверности [Гланц С., 1999; Власов В.В., 2001;]. Корреляционная связь прямая (положительные значения критерия) и обратная (отрицательные значения критерия) оценивалась качественно как:

  • при от 0,0 до –0,25 и до 0,25 – как отсутствие;
  • при от 0,26 до 0,50 (-0,26… -0,50) – как умеренную;
  • при от 0,51 до 0,75 (-0,51… -0,75) – как среднюю;
  • при с абсолютной величиной более 0,75 – как сильную,

согласно предложенным рекомендациям [Власов В.В., 2001].

Для расчетов использован статистический пакет Microsoft Excel-2002, программные пакеты SPSS 11.5 и БИОСТАТИСТИКА 4.03 для операционной системы WindowsXP.

РЕЗУЛЬТАТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Pages:     || 2 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»