WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||

Исследовали активность ранней и поздней глутамилэндопептидазы в присутствии парахлормеркурибензоата (п-ХМБ), используемого для анализа –SH-групп в структуре белков (рисунок 12).

Рисунок 12 Влияние п-ХМБ на активность препаратов глутамилэндопептидазы B. intermedius, соответствующих разным фазам роста рекомбинантного штамма B. subtilis.

А протеиназа фазы замедления роста; Б протеиназа стационарной фазы роста;

За 100% принята активность в отсутствие п-ХМБ

В присутствие п-ХМБ в реакционной смеси в концентрациях 2-10 мМ активность препарата раннего фермента оставалась без изменения, что свидетельствует об отсутствии свободных SH-групп в структуре фермента. Присутствие ингибитора в концентрациях 2-5 мМ снижало активность позднего белка на 60%, а в концентрациях 10-20 мМ полностью ингибировало фермент.

Соли ртути HgNO2, используемые в анализе белков как реагенты на –SH-группы, в концентрациях 10-20 мМ незначительно снижали активность ранней глутамилэндопептидазы (10-20%), но в концентрации 20 мМ ингибировали активность позднего белка на 80% (рисунок 13). Данные позволяют предположить наличие SH-групп структуре поздней глутамилэндопептидазы.

Рисунок 13 Влияние HgNO2 на активность препаратов глутамилэндопептидазы B. intermedius, соответствующих разным фазам роста рекомбинантного штамма B. subtilis.

А протеиназа фазы замедления роста; Б протеиназа стационарной фазы роста;

За 100% принята активность в отсутствие HgNO2

Дисульфидная связь стабилизирует структуру глутамилэндопептидазы, что является важным фактором, определяющим уровень молекулярной активности раннего белка. Восстановление этой связи соответствует позднему ферменту с более низким уровнем каталитической активности. Полученные нами данные позволили предположить, что статус дисульфидной связи определяет степень молекулярной активности белка на разных стадиях роста.

При переходе к спорообразованию бактериальная клетка претерпевает несколько стадий морфогенеза, которые сопровождаются сменой белковых компонентов клеточной оболочки, среди которых фолдинговые эффекторы и шапероны, участвующие в активации секретируемых белков. Мы предполагаем, что конформационная подвижность глутамилэндопептидазы выявленная в наших исследованиях, определяется набором эффекторов, участвующих в формировании третичной структуры в соответствии со стадией роста.

Будучи ферментом с узкой субстратной специфичностью, глутамилэндопептидаза выполняет не столько трофическую, а скорее регуляторную роль. Ограниченный протеолиз является молекулярным механизмом контроля на посттрансляционном уровне, вызывая образование, инактивацию и модификацию биорегуляторов белковой и пептидной природы. Становится очевидным, что протеиназам принадлежит первостепенная роль в реализации межклеточных взаимодействий на уровне бактериальных популяций. В качестве сигнальных молекул в этом случае могут быть пептиды – продукты расщепления протеиназ. В ходе эволюции протеолитических белков переход от ферментов катаболизма к ферментам-биорегуляторам осуществлялся за счет усложнения структуры связывающего центра, обеспечивающего специфичность и скорость гидролиза. В связи с чем, исследования глутамилспецифичных эндопептидаз, обнаруженных у бацилл, патогенных бактерий, вирусов и стрептомицетов, представляют существенный интерес во взаимосвязи с важнейшими физиологическими процессами, такими как морфогенез, адаптация, пролиферация, патогенез и дифференцировка. Нами впервые выявлена модуляция активности внеклеточной глутамилэндопептидазы на разных стадиях роста и дифференцировки бацилл. Эти данные могут служить основой для молекулярного механизма контроля уровня функциональной активности белка в зависимости от фазы развития микроорганизмов.

Таким образом, результаты сравнительного исследования свойств раннего и позднего фермента позволяют расширить наши представления о способах регуляции функциональной активности глутамилэндопептидаз, малоизученной подгруппы секретируемых сериновых протеиназ, при переходе бацилл в анабиотическое состояние.

ВЫВОДЫ

  1. Подобраны компоненты питательной среды, для получения высокого уровня активности ранней (24 ч роста) и поздней (48 ч роста) глутамилэндопептидазы B. intermedius в культуральной жидкости рекомбинантного штамма B. subtilis.
  2. Выделена и очищена глутамилэндопептидаза B. intermedius, соответствующая фазе замедления роста и стационарной фазе роста рекомбинантного штамма, со степенью очистки, составляющей 1257 для ранней и 1350 – для поздней протеиназы и выходом 7.8% и 12.5%, соответственно. Молекулярная масса ранней и поздней глутамилэндопептидазы составляет 23 кДа.
  3. Методом масс-спектрометрии установлено, что ранняя и поздняя глутамилэндопептидаза имеет идентичную последовательность аминокислот, N- и C- концы которой совпадают.
  4. Установлены различия в каталитических свойствах глутамилэндопептидазы, секретируемой в фазе замедления роста и стационарной фазе бактерий.
  5. Установлено, что уровень каталитической активности глутамилэндопептидазы, соответствующей разным стадиям роста бактерий, определяется статусом дисульфидной связи в конформации белка.

Работы, опубликованные по теме диссертации

  1. Шагимарданова, Е. И. Гетерологичная экспрессия гена глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius штаммами Bacillus subtilis, дефектными по регуляторным белкам [Текст]/ Е. И. Шагимарданова, И. Б. Частухина, Т. Р. Шамсутдинов, Н. П. Балабан, А. М. Марданова, С. В. Костров, М. Р. Шарипова // Микробиология, - 2007. - Т.76. - №5. - С. 645-651.
  2. Соколова, Е. А. Оптимизация выделения внеклеточных протеиназ Bacillus intermedius 3-19, секретируемых бактериями в поздней стационарной фазе роста [Текст] / Е. А. Соколова, Т. Р. Шамсутдинов, Н. П. Балабан // Ученые Записки Казанского университета. – 2007. – Т.149, Серия Естественные науки, Книга 2, №2. - С. 114-124.
  3. Sharipova, M. R. The expression of Bacillus intermedius glutamyl endopeptidase gene in Bacillus subtilis recombinant strains [Тext] / M. R. Sharipova, I. B. Chastukhina, E. I. Shagimardanova, T. R. Shamsutdinov, N. P. Balaban, A. M. Mardanova, L. A. Gabdrakchmanova, G. N. Rudenskaya, I. V. Demiduk, S. V. Kostrov // Molecular Biology Reports. – 2007. V.34.- P. 79-87.
  4. Шамсутдинов, Т. Р. Выделение и характеристика глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius, секретируемой рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis на разных фазах роста [Текст] / Т. Р. Шамсутдинов, Н. П. Балабан, А. М. Марданова, Ю. В. Данилова, Г. Н. Руденская, М. Р. Шарипова // Биоорганическая химия, - 2008. - Т.34. - №3. - С. 322-326.
  5. Balaban, N. P. Isolation and characterization of Bacillus amyloliquefaciens endopeptidase that is secreted in ditterent growth phase [Тext] / N. P. Balaban, A. M. Mardanova, L. A. Malikova, T. R. Shamsutdinov, O. N. Ilinskaya, G. N. Rudenskaya, M. R. Sharipova // Annals of Microbiology. – 2008. – V. 58 (4). -P. 1-8.
  6. Маликова, Л. А. Субтилизиноподобные протеиназы Bacillus amyloliquefaciens [Текст] / Л. А. Маликова, Т. Р. Шамсутдинов, Г. Н. Руденская, А. М. Марданова, Н. П. Балабан // Материалы XIII международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение». Казань, 2005. - С. 55-56.
  7. Маликова, Л. А. Особенности контроля биосинтеза субтилизинов, секретируемых Bacillus pumilus KMM 62 [Текст] / Л. А. Маликова, Т. Р. Шамсутдинов, О. В. Соколова, А. М. Марданова. // Материалы 9-ой международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века», Пущино, 2005. - С. 201.
  8. Шагимарданова, Е. И. Молекулярные механизмы регуляции экспрессии гена глутамилэндопептидазы B. intermedius рекомбинантным штаммом B. subtilis [Текст] / Е. И. Шагимарданова, Т. Р. Шамсутдинов, И. Б. Частухина, М. Р. Шарипова // Материалы V Республиканской научно- практической конференции молодых ученых и специалистов «Наука, инновации, бизнес», Казань, 2005. - С. 60-61.
  9. Шамсутдинов, Т. Р. Оптимизация среды для биосинтеза глутамилэндопептидазы B. intermedius рекомбинантным штаммом B. subtilis [Текст] / Т. Р. Шамсутдинов, Е. И. Шагимарданова, Л. А. Маликова, Н. П. Балабан, М. Р. Шарипова // Материалы V Республиканской научно- практической конференции молодых ученых и специалистов «Наука, инновации, бизнес», Казань, 2005. С. 53-54.
  10. Шамсутдинов, Т. Р. Оптимизация среды для биосинтеза глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis AJ 73 [Текст] / Т. Р. Шамсутдинов, Е. И. Шагимарданова, Л. А. Маликова, Н. П. Балабан // Материалы Молодежной школы конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, 2005. - С. 111-113.
  11. Шагимарданова, Е. И. Регуляция синтеза глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius рекомбинантными клетками Bacillus subtilis в стационарной фазе роста [Текст]/ Е. И. Шагимарданова, Т. Р. Шамсутдинов, И. Б. Частухина // Материалы XLIII международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс», Новосибирск, 2005. - С. 92-93.
  12. Shagimardanova, E. I Analysis of regulatory region of Bacillus intermedius glutamyl endopeptidase gene [Тext] / E. I. Shagimardanova, T. R. Shamsutdinov, I. B. Chastuchina, M. R. Sharipova // BGRS-2006: Proceedings of the fifth international conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure, Novosibirsk, Russia, 2006. - P. 156-160.
  13. Шамсутдинов, Т. Р. Влияние системы регуляции азотного обмена на биосинтез сериновых протеиназ B. intermedius в клетках B. subtilis [Текст] / Т. Р. Шамсутдинов, А. Р. Каюмов, Р. А. Байрамов, М. Р. Шарипова // Материалы международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006», Москва, 2006. - C. 248.
  14. Шамсутдинов, Т. Р. Влияние системы регуляции азотного обмена на биосинтез сериновых протеиназ B. intermedius в клетках B. subtilis [Текст] / Т. Р. Шамсутдинов, А. Р. Каюмов, Р. А. Байрамов, М. Р. Шарипова // Биология – наука XXI века: Сборник тезисов / 10-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых, Пущино, 2006. - С. 60.
  15. Шамсутдинов, Т. Р. Влияние системы регуляции азотного обмена на биосинтез сериновых протеиназ B. intermedius в клетках B. subtilis [Текст] / Т. Р. Шамсутдинов, А. Р. Каюмов, А. Р. Сабирова, М. Р. Шарипова // «Материалы и технологии XXI века»: тезисы докладов / VI Научная конференция молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета, Казань, 2006. – С. 125
  16. Шамсутдинов, Т. Р. Экспрессия генов сериновых протеиназ Bacillus intermedius в клетках Bacillus subtilis, дефектных по NRGB-регуляторному белку [текст] / Т. Р. Шамсутдинов, А. Р. Каюмов, М. Р. Шарипова // Материалы VI симпозиума «Химия протеолитических ферментов», Москва, 2007. - С. 62.
  17. Шагимарданова, Е. И. Гетерологичная экспрессия гена глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius [Текст] / Е. И. Шагимарданова, И. Б. Частухина, Т. Р. Шамсутдинов, М. Р. Шарипова // Материалы VI симпозиума «Химия протеолитических ферментов», Москва, 2007. - С. 63.
  18. Шамсутдинов, Т. Р. Свойства глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius, продуцируемой рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis на разных фазах роста [Текст] / Т. Р. Шамсутдинов, А. А. Тойменцева, Ю. В. Данилова, А. М. Черемин, Н. П. Балабан, А. М. Марданова, М. Р. Шарипова // Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008.- С. 381.
  19. Данилова, Ю. В. Характеристика глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius, секретируемой на разных фазах роста рекомбинантного штамма Bacillus subtilis [Текст] / Ю. В. Данилова, А. М. Черемин, Т. Р. Шамсутдинов // Материалы XLVI международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс", Новосибирск, 2008. - С. 35.
  20. Каюмов, А. Р. Экспрессия генов сериновых протеиназ Bacillus intermedius в клетках Bacillus subtilis в условиях азотного голодания [Текст] / А. Р. Каюмов, Т. Р. Шамсутдинов, А. Р. Сабирова, К. П. Федорова, А. И. Ахметова, М. Р. Шарипова // Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008. - С. 148.
  21. Шарипова, М. Р. Вклад сигнальной трансдукции в формирование клеточного ответа в стационарной фазе бацилл [Текст] / М. Р. Шарипова, Н. П. Балабан, А. М. Марданова, А. Р. Каюмов, Т. Р. Шамсутдинов, Е. О. Михайлова, А. Р. Сабирова, А. А. Тойменцева, Н. Л. Рудакова [Текст] // Материалы докладов Cъезда c международным участием «IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов», Новосибирск, 2008. - С.
    Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»