WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

95 QYDFAVIKTDTNIGNTVGYRSIRQVTNLTGTTIKISGYPGDKMRSTG

95 QYDFAVIKTDTNIGNTVGYRSIRQVTNLTGTTIKISGYPGDKMRSTG

142 KVSQWEMSGSVTREDTNLAYYTIDTFSGNSGSAMLDQNQQIVGVHNA

142 KVSQWEMSGSVTREDTNLAYYTIDTFSGNSGSAMLDQNQQIVGVHNA

189 GYSNGTINGGPKATAAFVEFINYAKAQ 215 -- Ранний белок

189 GYSNGTINGGPKATAAFVEFINYAKAQ 215 -- Поздний белок

Рисунок 6 Аминокислотная последовательность глутамилэндопептидазы B. intermedius, секретируемой рекомбинантным штаммом B. subtilis на разных фазах роста, полученная с помощью MALDI-TOF анализа.

Электрофорез в неденатурирующих условиях показал наличие одной полосы для обоих препаратов, а значит фермент, соответствующий разным стадиям роста, представляет собой мономерный белок (рисунок 7).

Сравнительная характеристика глутамилэндопептидазы разных фаз роста. Исследовали действие ингибиторов различной природы на активность глутамилэндопептидазы B. intermedius, секретируемой рекомбинантным штаммом B. subtilis на разных стадиях роста.

Согласно полученным данным, ранняя и поздняя глутамилэндопептидаза не чувствительна к действию ингибиторов металлопротеиназ: ЭДТА и о-фенантролина. Активность фермента полностью подавлялась специфическим ингибитором сериновых протеиназ – диизопропилфторфосфатом (DFP). Полное подавление со стороны специфического ингибитора сериновых протеиназ указывает на принадлежность белка к этому классу ферментов.

Фенилметилсульфонилфторид (PMSF) частично ингибировал активность протеиназы, причем, активность позднего фермента ингибировалась на 35%, а фермента, соответствующего вегетативному росту только на 15% (таблица 3). Имидазол, бензамидин и белковые ингибиторы снижают активность позднего фермента, в то время как на активность раннего фермента не влияют. Полученные данные могут свидетельствовать о различии конформационного статуса белка разных фаз роста.

Таблица 3

Влияние ингибиторов на активность препаратов глутамилэндопептидазы

B. intermedius

Ингибиторы

Мол. соотн.

фермент: ингибитор

Субстрат

Z-Glu-pNA

Остаточная

активность, %

Ранняя

глутамилэндопептидаза

Поздняя глутамилэндопептидаза

DFP

1:100

0

0

PMSF

1:100

85

65

ЭДТА

1:100

100

100

о-фенантролин

1:100

100

100

Имидазол

1:100

100

75

Бензамидин

1:100

100

60

Соевый ингибитор трипсина

1:10

100

85

Овомукоид утиный

1:10

100

70

* - 10%

Изучение субстратной специфичности глутамилэндопептидазы, выделенной на разных фазах роста рекомбинантного штамма, проводили по гидролизу различных синтетических пептидных и белковых субстратов (таблица 4).

Активность обоих препаратов по отношению к синтетическим пептидам, содержащим остаток глутаминовой кислоты выше, чем на субстратах, содержащих остаток аспарагиновой кислоты, что характерно для ферментов этой группы. Полученные данные позволили достоверно установить, что препарат ранней глутамилэндопептидазы характеризуется более высокой скоростью расщепления синтетических субстратов по сравнению с поздним ферментом. Удельная активность раннего белка на синтетических пептидах в 3-5 раз выше, чем позднего. Та же закономерность сохраняется при расщеплении белковых субстратов, активность по расщеплению которых в 2-5 раз выше для раннего фермента.

Специфичность обоих препаратов фермента исследовали по расщеплению окисленной В-цепи инсулина (рисунок 8).

Таблица 4

Субстратная специфичность глутамилэндопептидазы разных фаз роста по гидролизу синтетических и белковых субстратов

Cубстрат

Удельная активность, ед/мг

ранний фермент

поздний фермент

Z-Ala-Ala-Phe-Glu-pNA

188

55,6

Z-Ala-Ala-Leu-Glu-pNA

179

63,2

Z-Ala-Ala-Met-Glu-pNA

162

31,6

Z-Gly-Ala-Ala-Glu-pNA

52,5

15

Z-Ala-Ala-Trp-Glu-pNA

39

8,8

Z-Ala-Ala-Leu-Asp-pNA

10,4

2,5

Z-Ala-Ala-Trp-Asp-pNA

7

2

Z-Ala-Ala-Met-Asp-pNa

4,7

1,1

Z-Ala-Ala-Phe-Asp-pNA

1,9

0,4

Z-Gly-Ala-Ala-Asp-pNA

0,9

0,2

Азоальбумин

11,3

8

Азоказеин

10,1

2,9

Казеин

9,9

2,1

F-V-N-Q-H-L-C-G-S-H-L-V-E-A-L-Y-L-V-C-G-E-R-G-F-F-Y-T-P-K-A-

Рисунок 8 Гидролиз В-цепи инсулина глутамилэндопептидазой B. intermedius, секретируемой рекомбинантным штаммом B. subtilis на разных фазах роста.

Полученные данные показали, что ранняя протеиназа гидролизует окисленную В-цепь инсулина по остатку глутаминовой кислоты и двум остаткам цистеиновой кислоты. А поздняя протеиназа гидролизует В-цепь инсулина только по остатку глутаминовой кислоты. Таким образом, препараты глутамилэндопептидазы различаются по степени гидролиза окисленной В-цепи инсулина.

Константы Михаэлиса для протеиназы, разных стадий роста определяли по гидролизу специфического хромогенного субстрата. Из графика, построенного в координатах Лайнуивера–Берка, следует, что Km для ранней протеиназы составила 4,3 мМ, а для поздней – 8,8 мМ. Каталитическая константа kcat (1437c-1) раннего белка выше, чем позднего (887c-1), что указывает на более эффективное расщепление субстрата, по сравнению с поздним ферментом.

Таким образом, каталитические константы и результаты определения субстратной специфичности позволяют сделать вывод о более высокой удельной активности и скорости гидролиза субстратов для ранней глутамилэндопептидазы.

Исследовали зависимость активности глутамилэндопептидазы разных стадий роста от температуры в отсутствие и присутствии 5 мМ ионов Са2+ (рисунок 9). Ранняя глутамилэндопептидаза проявляет максимальную активность при 45° С в отсутствии ионов Са2+, активность резко снижается при 50-55° С. Присутствие ионов Са2+ в реакционной смеси сдвигает оптимум температуры на 15° С и увеличивает активность на 20%.

Рисунок 9 Температурный оптимум препаратов глутамилэндопептидазы B. intermedius:

А-ранняя глутамилэндопептидаза; Б-поздняя глутамилэндопептидаза

1-активность в отсутствие ионов Са2+; 2-активность в присутствии ионов Са2

Максимальная активность поздней глутамилэндопептидазы в отсутствии ионов Са2+ наблюдается в диапазоне температур от 37 до 50°С, при 55°С фермент теряет активность. В присутствии ионов Са2+ фермент проявляет максимальную активность при 45°С, причем активность увеличивается почти в 2 раза по сравнению с таковой без ионов Са2+. При исследовании термостабильности установлено, что термостабильность раннего фермента превышает на 5-8° термостабильность позднего белка и увеличивается в присутствии Са2+.

Препараты ранней и поздней глутамилэндопептидазы стабильны в диапазоне рН 7,5-9,5, причем ранний фермент проявляет более высокую рН-стабильность по сравнению с поздним белком: его активность начинает снижаться при рН выше 9.5, тогда как активность позднего фермента снижается при рН 9,0.

Известно, что ионы двухвалентных металлов стабилизируют молекулу фермента и необходимы для формирования функционально-активной конформации протеиназ. Исследование влияния ионов двухвалентных металлов на активность глутамилэндопептидазы показало, что активность раннего белка увеличивается в среднем на 20% в присутствии ионов Са2+, Mg2+, Mn2+ и Co2+ (рисунок 10). Поздний фермент оказался более чувствительным к воздействию ионов металлов. Ионы Са2+ и Мg2+ в концентрации до 20 мМ приводили к возрастанию активности фермента в 2-2,5 раза. Ионы Мn2+ и Co2+в концентрациях 2,5-10 мМ увеличивали активность поздней протеиназы в среднем на 40-50%. По-видимому, на разных стадиях роста происходят изменения в конформационной структуре молекулы, природу которых мы соотносим с формированием элементов вторичной структуры.

Рисунок 10 Влияние ионов двухвалентных металлов на активность ранней и поздней глутамилэндопептидазы B. intermedius рекомбинантного штамма B. subtilis.

А ранняя протеиназа; Б поздняя протеиназа;

1 ионы Са2+; 2 ионы Mg2+; 3 ионы Mn2+; 4 ионы Со2+

За 100% принята активность препарата глутамилэндопептидазы в отсутствие ионов металлов

Нуклеотидная последовательность гена глутамилэндопептидазы B.intermedius [Rebrikov et al., 1999] и рентгено-структурный анализ белка [Meijers et al, 2004] указывают на присутствие дисульфидной связи в белковой глобуле глутамилэндопептидазы. Мы предположили, что обнаруженные нами конформационные изменения могут соответствовать статусу дисульфидной связи в структуре фермента.

Исследовали влияние дитиоэритритола (ДТЭ), реагента для восстановления дисульфидных связей на активность глутамилэндопептидазы B. intermedius разных фаз роста (рисунок 11). В присутствии ДТЭ в концентрациях от 1 до 100 мМ активность раннего фермента падала на 50-60%. Эти данные свидетельствуют о наличие дисульфидной связи в конформационной структуре глутамилэндопептидазы.

Активность позднего фермента в присутствии тех же концентраций ДТЭ оставалась без изменения. Полученные данные указывают на восстановленное состояние дисульфидной связи в структуре поздней глутамилэндопептидазы.

Рисунок 11 Влияние дитиоэритритола на активность препаратов глутамилэндопептидазы B. intermedius, соответствующих разным фазам роста рекомбинантного штамма B. subtilis.

А протеиназа фазы замедления роста, Б протеиназа стационарной фазы роста;

За 100% принята активность в отсутствие ДТЭ

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»