WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Изучение влияния ионов 2-х валентных металлов на активность фермента проводили с использованием солей MgSO4, CaCl2, MnSO4, CoCl2. К раствору белка добавляли раствор соответствующей соли до конечных концентраций (1; 2.5; 5; 10 и 20 мМ) и выдерживали в течение 10 мин. В качестве контроля (100%) принимали активность фермента без ионов металлов.

Математическую обработку полученных данных проводили в программной среде «Microsoft Excel». Результаты многофакторных экспериментов обрабатывали с помощью программы STATGRAPHICS.

Результаты исследований и их обсуждение

Динамика роста и накопления глутамилэндопептидазы B. intermedius в культуральной жидкости рекомбинантного штамма B. subtilis. После трансформации плазмиды 58.21, несущей ген глутамилэндопептидазы B. intermedius под собственным промотором, в протеазо-дефицитный лабораторный штамм B. subtilis JB 20-36 изучали экспрессию гена в рекомбинантном штамме. Выбор штамма-реципиента определялся отсутствием у него протеолитической активности в культуральной жидкости, что позволяет получить модельный штамм для изучения экспрессии индивидуального гена и корректно провести выделение и очистку соответствующего белка на разных фазах культивирования.

При исследовании динамики накопления внеклеточной глутамилэндопептидазы нами обнаружены два максимума накопления протеолитической активности по расщеплению специфического хромогенного субстрата Z-Glu-pNA: в фазе замедления роста (24 ч) (ранний фермент) и в поздней стационарной фазе роста (48 ч) (поздний фермент) (рисунок 1). При этом уровень накопления раннего фермента в 1,5 раза превышал таковой в поздней стационарной фазе роста культуры. Удельная скорость накопления ранней глутамилэндопептидазы (, ед.акт.ч-1) в культуральной жидкости возрастала в период, когда удельная скорость роста культуры падала (, ед.акт.ч-1), т.е. согласно модели Колемана эта протеиназа может быть охарактеризована как катаболитный фермент [Coleman et al., 1975].

Рисунок 1 Динамика роста, спорообразования и накопления глутамилэндопетидазы рекомбинантного штамма B. subtilis.

А – ранняя глутамилэндопетидаза; Б – поздняя глутамилэндопетидаза

1 – рост культуры, ОD590

2 – активность глутамилэндопетидазы рекомбинантного штамма B. subtilis. (ед/мл)

3 – удельная скорость роста (, ед.акт.ч-1)

4 – удельная скорость накопления глутамилэндопетидазы (, ед.акт.ч-1)

5 – количество свободных спор, %

Полученные данные свидетельствуют, что экспрессия гена глутамилэндопептидазы у рекомбинантного штамма характеризуется двумя максимумами активности фермента, что взаимосвязано с физиологическим циклом бацилл.

Подбор питательной среды. Для выделения и очистки внеклеточной глутамилэндопептидазы разных фаз роста бактерий, проводили подбор компонентов питательной среды для эффективной продукции фермента на соответствующие часы роста микроорганизмов. Варьировали концентрации основных источников азота – пептона и триптона в составе среды культивирования. Наряду с этими источниками питания использовали гидролизат коллагена (колламин) в качестве более доступной замены пептона и триптона в условиях масштабирования процесса очистки белка. Как видно из таблицы 1, максимальный уровень активности глутамилэндопептидазы в культуральной жидкости наблюдался в опытах с пептон-содержащей средой и средой LB без внесения дополнительных компонентов и замен одного источника азота на другой: пептона и триптона - на гидролизат коллагена (колламин), бактериологического пептона - на ферментативный пептон.

Таблица 1

Подбор питательной среды для максимальной продукции глутамилэндопептидазы B. intermedius, секретируемой рекомбинантным штаммом B. subtilis на разных фазах роста

Состав питательной среды

Активность, ед/мг

В фазе замедления роста

В стационарной фазе

LB

1,12

0,5

LB+1% колламин

0,33

0,2

LB+2% колламин

0,25

0,15

LB (триптон1% колламин)

0,6

0,22

LB (триптон2% колламин)

0,7

0,38

Пептон-содержащая среда

(бактериологический пептон, 20 г/л)

1,33

0,58

Пептон-содержащая среда+1% колламин

0,55

0,21

Пептон-содержащая среда+2% колламин

0,33

0,18

Пептон-содержащая среда

(пептон1% колламин)

0,63

0,29

Пептон-содержащая среда

(пептон2% колламин)

0,6

0,31

Пептон-содержащая среда

(ферментативный пептон, 20 г/л)

0,65

0,4

Пептон-содержащая среда

(ферментативный пептон, 30 г/л)

0,75

0,43

Пептон-содержащая среда

(ферментативный пептон, 40 г/л)

0,71

0,41

Активность фермента в пептон-содержащей среде составила для ранней глутамилэндопептидазы – 1,33 ед/мг, для поздней – 0,58 ед/мг, в среде LB – 1,12 и 0,5 ед/мг соответственно. Замена пептона на гидролизат коллагена (колламин), а также внесение последнего в качестве дополнительного источника питания снижали активность протеиназы более, чем в 2 раза (0,6 – 0,55 ед/мг – для ранней протеиназы, 0,31 – 0,21 ед/мг – для поздней протеиназы). Использование ферментативного пептона в концентрациях 10 – 30 г/л вместо бактериологического пептона приводило к снижению активности глутамилэндопептидазы, но в меньшей степени, чем при использовании гидролизата коллагена (колламина) (0,65 – 0,71 ед/мг – для ранней протеиназы, 0,4 – 0,41 ед/мг – для поздней протеиназы). Таким образом, применение гидролизата коллагена (колламина) и ферментативного пептона в составе питательной среды нецелесообразно. Поэтому для очистки глутамилэндопептидазы из культуральной жидкости рекомбинантного штамма использовали среду LB и пептон-содержащую среду.

Исследовали влияние соотношения двух основных компонентов питательной среды – пептона и неорганического фосфата на биосинтез ранней и поздней глутамилэндопептидазы в двухфакторных экспериментах. Оптимальное соотношение концентраций двух основных компонентов питательной среды – пептона и неорганического фосфата для эффективной продукции фермента на разных фазах роста культуры подбирали в многофакторных экспериментах с последующей обработкой результатов в программе STATGRAFICS. Результаты двухфакторных экспериментов представлены на рисунке 2 в виде линий уровня активности глутамилэндопептидазы, где выделяется оптимальная по двум рассматриваемым факторам зона.

Итак, максимальные значения по активности глутамилэндопептидазы, секретируемой рекомбинантным штаммом на 24-й час культивирования наблюдаются при концентрации в среде пептона 30,5 г/л и неорганического фосфата 0,34 г/л, на 48-й час культивирования - при концентрации в среде пептона 30 г/л и неорганического фосфата 0,25 г/л.

Таким образом, подобрано оптимальное соотношение в среде концентраций пептона и неорганического фосфата для получения глутамилэндопептидазы на разных стадиях роста бацилл.

Очистка глутамилэндопептидазы разных фаз роста. Глутамилэндопептидазу B. intermedius выделяли из культуральной жидкости на разных фазах роста бактерий: на 24 и 48 ч и подвергали процедуре очистки (таблица 2). Выделение фермента из освобожденной от клеток культуральной жидкости проводили с помощью ионообменной хроматографии на КМ – целлюлозе. Это позволило за одну стадию очистки получить глутамилэндопептидазу со степенью очистки в 250-300 раз с выходом 31 и 38,8%, для раннего и позднего фермента соответственно. Последующую очистку проводили на колонке Mono S в системе FPLC-хроматографии. Ранняя глутамилэндопептидаза получена со степенью очистки 1257 и выходом 12,5%. Степень очистки поздней глутамилэндопептидазы составила 1350 с выходом фермента 7,8%.

Таблица 2

Очистка глутамилэндопептидазы B. intermedius, секретируемой рекомбинантным штаммом B. subtilis

Стадии очистки

V, мл

Белок общ., ед.

Активность

общ.,

ед. акт.

Уд. акт. ед. акт./А280

Степень очистки

Выход, %

Культуральная жидкость

Ранняя протеиназа

Поздняя протеиназа

1850

33300

46.3

0.0014

1

100

1900

43700

41.8

0.001

1

100

Хроматография на КМ-целлюлозе

Ранняя протеиназа

Поздняя протеиназа

44

42.5

18.0

0.42

300

38.8

46

50.6

12.9

0.25

250

31.0

Хроматография на колонке MonoS

Ранняя протеиназа

Поздняя протеиназа

15

3.3

5.8

1.76

1257

12.5

12

2.4

3.25

1.35

1350

7.8

Хроматографические профили ранней и поздней глутамилэндопептидазы B. intermedius рекомбинантного штамма представлены на рисунке 3.

Чистота очищенного фермента исследована с помощью электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях (рисунок 4). Ранняя и поздняя глутамилэндопептидазы представлены одной белковой полосой, подтверждающей гомогенность белка.

Проводили иммунологический анализ глутамилэндопептидазы с использованием кроличьей антисыворотки против гомогенной глутамилэндопептидазы, полученной из культуральной жидкости B. intermedius 3-19. Методом иммунодиффузии для фермента разных фаз роста показано образование преципитатов против лунки, содержащей антисыворотку к глутамилэндопептидазе исходного штамма B. intermedius (рисунок 5). Полученные результаты указывают на идентичность глутамилэндопептидазы, продуцируемой рекомбинантными клетками B. subtilis, ферменту, синтезируемому исходным штаммом B. intermedius. Вместе с тем, данные экспериментов свидетельствуют об идентичности аминокислотной последовательности глутамилэндопептидазы, соответствующей разным стадиям роста.

Препараты протеиназы, 24 и 48 ч роста бактерий анализировали методом MALDI-TOF - масс-спектрометрии, который позволил установить первичную структуру аминокислотной последовательности и молекулярную массу исследуемого белка (рисунок 6).

Глутамилэндопептидаза разных фаз роста по результатам MALDI-TOF имеет молекулярную массу 22,7 кДа, что совпадает с данными, полученными методом SDS-электрофореза.

1 VVIGDDGRTKVANTRVAPYNSIAYITFGGSSCTGTLIAPNKILTNGH

1 VVIGDDGRTKVANTRVAPYNSIAYITFGGSSCTGTLIAPNKILTNGH

48 CVYNTASRSYSAKGSVYPGMNDSTAVNGSANMTEFYVPSGYINTGAS

48 CVYNTASRSYSAKGSVYPGMNDSTAVNGSANMTEFYVPSGYINTGAS

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»