WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

ШАМСУТДИНОВ ТАЛГАТ РАХИМЗЯНОВИЧ

ГЛУТАМИЛЭНДОПЕПТИДАЗА BACILLUS INTERMEDIUS, СЕКРЕТИРУЕМАЯ РЕКОМБИНАНТНЫМ ШТАММОМ BACILLUS SUBTILIS НА РАЗНЫХ ФАЗАХ РОСТА

03.00.07 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Казань – 2009

Работа выполнена в лаборатории биосинтеза и биоинженерии ферментов кафедры микробиологии биолого-почвенного факультета ГОУ ВПО «Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина».

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор

Шарипова Маргарита Рашидовна

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, старший научный сотрудник, г. Казань

Коксин Владимир Петрович

Доктор ветеринарных наук, профессор, г. Казань

Алимов Азат Миргасимович

Ведущая организация:

Казанский институт биохимии и биофизики КНЦ РАН, г. Казань

Защита диссертации состоится «26» марта 2009 г. в часов на заседании диссертационного совета Д.212.081.08 при Казанском государственном университете им. В.И. Ульянова-Ленина по адресу: 420008, г. Казань,
ул. Кремлевская, 18, главное здание, ауд. 211.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского государственного университета

Автореферат разослан «24» февраля 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор

З.И. Абрамова

Актуальность проблемы. Интерес к микробным ферментам и, в частности, к протеиназам бацилл, объясняется недостаточной способностью протеолитических белков животного и растительного происхождения удовлетворять спрос на жизненные потребности населения планеты. Микроорганизмы являются источником всех типов гидролаз благодаря широкому разнообразию, простоте культивирования, безопасности в работе, способности к генетическим преобразованиям. Использование ферментов имеет ряд преимуществ по сравнению с химическими веществами. Протеолитические белки микроорганизмов высокоактивны, доступны и легко биодеградируются. В последние годы наблюдается интенсивное развитие биотехнологического производства бактериальных ферментов, область применения которых – промышленность, медицина, научные исследования.

Одной из наиболее интересных групп класса протеолитических ферментов являются сериновые протеиназы бацилл. Эти белки участвуют в адаптационных процессах в условиях стресса, спорообразовании и прорастании спор. Неослабевающий интерес к этим белкам обусловлен широтой их практического применения. Выход целевого продукта у бацилл может быть существенно повышен за счет направленного воздействия на условия роста, использования штаммов с нарушениями систем регуляции, либо модификацией гена. На основе протеиназ бацилл конструируют каталитические антитела с протеолитической активностью. Выделены протеиназы бацилл, обладающие фибринолитическими и тромболитическими свойствами. В связи с ростом числа заболеваний, связанных с тромбообразованием, актуальным является поиск новых ферментов с высокой активностью, специфичностью и низкой токсичностью. Одной из подгрупп сериновых протеиназ являются глутамилэндопептидазы, обладающие узкой субстратной специфичностью. Поэтому они являются высокоточными "инструментами" для фрагментации белковых молекул при исследовании первичной структуры.

Поскольку бациллы секретируют различные протеиназы, выделение индивидуальных белков контаминирует с белковыми примесями, которые затрудняют аналитические исследования фермента. Генно-инженерные методы позволяют создавать рекомбинантные штаммы, содержащие на плазмиде ген индивидуального белка, что перспективно для разработки способов получения гомогенных протеиназ.

Целью работы явилось выделение, очистка и сравнительная характеристика глутамилэндопептидазы B. intermedius, секретируемой рекомбинантным штаммом на разных фазах роста.

В работе решались следующие задачи:

1. Подбор условий культивирования для выделения глутамилэндопептидазы B. intermedius из культуральной жидкости рекомбинантного штамма B. subtilis на разных стадиях роста.

2. Выделение и очистка глутамилэндопептидазы B. intermedius из культуральной жидкости рекомбинантного штамма на разных стадиях роста.

3. MALDI-TOF анализ аминокислотных последовательностей глутамилэндопептидазы, соответствующей разным стадиям роста.

4. Сравнительное исследование свойств глутамилэндопептидазы разных фаз роста.

5. Выяснение роли дисульфидной связи в образовании конформеров глутамилэндопептидазы.

Научная новизна. Впервые выделена и охарактеризована глутамилэндопептидаза B. intermedius, секретируемая рекомбинантным штаммом B. subtilis на разных стадиях роста. Впервые проведена сравнительная характеристика свойств ранней и поздней глутамилэндопептидазы. Получены приоритетные данные, о различие их каталитических характеристик (Km и kcat). Установлено, что оба препарата идентичны по первичной структуре, их N- и С-концевые аминокислотные остатки совпадают. Впервые получены данные о содержании в структуре позднего фермента восстановленной дисульфидной связи в отличие от ранней глутамилэндопептидазы. Сравнительные исследования позволили заключить, что статус дисульфидной связи может определять степень молекулярной активности глутамилэндопептидазы разных фаз роста.

Практическая значимость. Подобраны условия культивирования бактерий для эффективной продукции глутамилэндопептидазы B. intermedius на разных стадиях роста для проведения эффективной очистки фермента. Полученный в работе рекомбинантный штамм B. subtilis может быть использован как эффективный продуцент глутамилэндопептидазы. Результаты работы могут быть использованы при разработке стратегии синтеза ферментов промышленными штаммами бактерий. Получение гомогенных препаратов ферментов увеличивает арсенал белков, используемых в научных исследованиях и в практических целях. Результаты исследования свойств раннего и позднего фермента рекомбинантного штамма B. subtilis позволит расширить наши представления о сериновых протеиназах, в частности, об особой подгруппе ферментов – глутамилэндопептидазах.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования: Работа выполнялась в соответствии с планом НИР КГУ (№ гос. регистрации 01.02.00 104982 «Биосинтез, биогенез, классификация, физиологические функции новых микробных ферментов и возможные области их практического применения»). Исследования поддержаны грантами РФФИ 05-04-48182-а, Академии наук РТ № 03-3.5-20 и Аналитической Ведомственной Целевой Федеральной Программы РНП 2.11.1005. Авторские исследования получили персональную поддержку Правительства Республики Татарстан (2007 г) и были удостоены именной стипендии президента Республики Татарстан.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработаны условия культивирования и получена глутамилэндопептидаза B. intermedius, соответствующая разным фазам роста рекомбинантного штамма.

2. Глутамилэндопептидаза, разных фаз роста характеризуется идентичной аминокислотной последовательностью, но отличается по каталитическим характеристикам и энзиматическим свойствам.

3. Дестабилизация глутамилэндопептидазы стадии позднего стационара по сравнению с соответствующим ферментом фазы замедления роста связана со статусом дисульфидной связи в белковой глобуле.

Апробация работы: Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных, всероссийских и региональных конференциях: "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2005, 2006, 2007), школах-конференциях молодых ученых “Биология – наука XXI века” (Пущино, 2005, 2006), Всероссийской научной конференции “Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение” (Казань, 2005), V республиканской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Наука. Инновации. Бизнес» (Казань, 2005), Международной конференции аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», (Москва, 2005, 2006), Материалах XLIII международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» секция биология (Новосибирск, 2005), VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007), Материалах докладов съезда c международным участием «IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов» (Новосибирск, 2008), Материалах XLVI международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2008).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 21 научных работ.

Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела экспериментальных исследований и обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 127 страницах машинописного текста, включает 5 таблиц, 24 рисунка. Библиография содержит 100 наименований российских и зарубежных авторов.

Благодарности: Автор выражает глубокую признательность научному руководителю проф. М.Р. Шариповой за внимательное отношение к работе; д.х.н., проф. Г.Н. Руденской за возможность проведения экспериментов на базе лаборатории кафедры химии природных соединений химического факультета МГУ; к.б.н., с.н.с. Н.П. Балабан, к.б.н., доц. А.М. Мардановой и к.б.н., доц. В.И. Вершининой за постоянную помощь в проведении экспериментов и обсуждении результатов; проф. С.В. Кострову (ИМГ РАН); к.б.н., с.н.с. И.В. Демидюку (ИМГ РАН) за предоставление плазмиды 58.21 и антисыворотки к глутамилэндопептидазе; проф. E. Феррари (Genencor Int. Inc., США) за предоставление протеазо-дефицитного штамма B. subtilis. Автор выражает искреннюю благодарность заведующей кафедрой микробиологии Казанского университета проф. О.Н. Ильинской и сотрудникам кафедры микробиологии за помощь и теплую рабочую атмосферу.

Материалы и методы

Штаммы и плазмиды. В работе использовали мультикопийную плазмиду 58.21, полученную на основе вектора pCB22 [Rebrikov et al., 1999] и любезно предоставленную для работы проф. Костровым С.В. (ИМГ РАН). Плазмида 58.21 содержала вставку размером 2.6 т.п.о. с геном глутамилэндопептидазы B. intermedius 3-19 под контролем собственных регуляторных элементов.

В качестве штамма-реципиента для плазмиды с геном глутамилэндопептидазы B. intermedius 3-19 использовали штамм B. subtilis JB 20-36 (apr, npr), из хромосомной ДНК которого делетированы гены внеклеточных протеиназ (проф. E. Феррари, Genencor Int. Inc., США).

Культивирование бактерий. Исходной питательной средой для культивирования рекомбинантных бактерий являлась пептон-содержащая среда [Частухина с соавт., 2005]. Для подбора оптимальной среды использовали гидролизат коллагена (колламин) («Биопрогресс», Россия) в концентрации 1% и 2% в качестве добавки к пептон-содержащей среде. Кроме того, производили замену пептона «Sigma» на ферментативный пептон «Диа-М» в концентрациях 10-30 г/л. В среду культивирования непосредственно перед посевом добавляли хлорамфеникол в концентрации 20 мкг/мл. Растворы неорганического фосфата (Na2HPO4) стерилизовали при 1 атм. и вносили в среду перед посевом в концентрациях 0,1-0,4 г/л.

Прирост биомассы измеряли нефелометрически на ФЭК-56М при 590 нм. Протеолитическую активность определяли по гидролизу синтетического хромогенного субстрата Z-Glu-pNA [Люблинская с соавт., 1987] и казеина [Каверзнева, 1971]. Удельную активность выражали в ед/мг белка.

Выделение и очистку глутамилэндопептидазы разных фаз роста из культуральной жидкости проводили методом ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе и колонке MonoS в системе FPLC («Pharmacia», Швеция).

Степень чистоты белковых препаратов и молекулярную массу определяли электрофорезом в денатурирующих условиях по методу Лаэммли [Laemmli, 1970] и в нативных условиях в 10% ПААГ, как описано на сайте (http://wolfson.huji.ac.il/purification/Protocols/PAGE_Acidic.html).

Гомогенные препараты белка, секретируемые на разных фазах роста культуры, анализировали с помощью метода масс-спектрометрии (MALDI-TOF). Полученные данные обрабатывали с помощью программ Peptide Mass Fingerprint (http://www.matrixscience.com.) и Peptide Mass (http://cn.expasy.org).

Иммуноферментный анализ проводили на кроличьих антителах к глутамилэндопептидазе B. intermedius 3-19. Кроличья антисыворотка к внеклеточной глутамилэндопептидазе B. intermedius любезно предоставлена для работы проф. Костровым С.В. (ИМГ РАН).

Субстратную специфичность глутамилэндопептидазы определяли, как описано в работе [Люблинская с соавт., 1987], на следующих синтетических тетрапептидах: Z-Ala-Ala-Met-Glu-pNa, Z-Ala-Ala-Trp-Glu-pNa, Z-Ala-Ala-Phe-Glu-pNa, Z-Ala-Ala-Leu-Glu-pNa, Z-Gly-Ala-Ala-Glu-pNa, Z-Ala-Ala-Trp-Asp-pNa, Z-Ala-Ala-Leu-Asp-pNa, Z-Ala-Ala-Phe-Asp-pNa, Z-Ala-Ala-Met-Asp-pNa, Z-Gly-Ala-Ala-Asp-pNa, а также Z-Glu-pNa. Специфичность глутамилэндопептидазы по отношению к природным субстратам определяли по гидролизу В – цепи окисленного инсулина, как описано в работе [Leshchinskaya et al., 1997].

Влияние ингибиторов на активность фермента определяли, используя диизопропилфторфосфат (DFP), фенилметилсульфонилфторид (PMSF), динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), о-фенантролин, бензамидин и имидазол (“Sigma”, Германия) в молярном соотношении фермент: ингибитор=1:100. Белковые ингибиторы: утиный овомукоид и соевый ингибитор трипсина (“Sigma”, Германия) использовали в молярном соотношении 1:10.

Свойства ферментов. Km и kcat препаратов протеиназ определяли по гидролизу специфического хромогенного субстрата Z-Glu-pNa с использованием двулучевого спектрофотометра Lambda 35 «Perkin Elmer» (США).

рН- и Т-оптимум, рН- и Т-стабильность протеиназ исследовали по гидролизу синтетического хромогенного субстрата Z-Glu-pNA с использованием 0,1М трис-HCl буфера с рН от 7,2 до 10,0 c ионами Са2+ в конечной концентрации 5 мМ.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»