WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |   ...   | 9 |

В зависимости отконцентрации фенольные соединенияоказывают либо ингибирующее, либостимулирующее действие на рост идлительность покоя. Намиизучено индивидуальное пероксидазноеокисление гидрохинона - классическогофенольного антиоксиданта в широкомдиапазоне рН и концентраций. Показано, чтореакция пероксидазного окислениягидрохинона характеризуется высокимиkсat, (1220-2225 с-1), что позволяетотнести этот субстрат к группе быстроокисляемых субстратов ПО, таких как ОДН, укоторого kсatпри рН 3,7-7,0 составляет 625-3540с-1. ВеличинаКm длягидрохинона достаточно низкая исоставляет 150-650 мкМ в зависимости от рН, чтопо величине соизмеримо с константойМихаэлиса для ферроцианида калия. Однакоэто в 10 раз хуже, чем Кm у ОДН. Кm и kсat, пероксидазногоокисления гидрохинона мало зависят от рН.Оптимум каталитической активностифермента приходится на рН 4,5-5,5. Связывание2-3 молекул субстрата с фермент-субстратнымкомплексом ингибирует ПО. Количествомолекул гидрохинона, ингибирующих фермент,зависит от рН, что возможно, вызваноизменениями в протяженностисубстратсвязывающего участка активногоцентра фермента, уменьшающегося в кислыхрН. Индивидуальное окисление гидрохинонапроисходит без образованияфермент-субстратного комплекса сполуокисленным субстратом. Данныймеханизм может наблюдаться в растениях дляокисления различных регуляторовроста.

3.2. Совместное окислениеантиоксидантов – регуляторный механизм с участиемпероксидазы растений

При совместномокислении АК и ГХ, осуществляетсяупорядоченный процесс окислениясубстратов, который определяетпреимущественное окисление медленноокисляемого субстрата. Очередностьзадается тем, что связывание АК сокисленными формами ПО на два порядкалучше, чем гидрохинона.

Предварительноесвязывание АК в активном центре ферментаулучшает в 28-420 раз последующее связываниемолекул гидрохинона. Однако, связавшись,гидрохинон не оказывает влияние насвязывание второй молекулы АК, чтовыражается в неконкурентном типеактивирования. Присутствие гидрохинона вактивном центре фермента способствуетускорению окисления молекул АК в 4-41 раз.Особенно этот эффект проявляется при рН5,5-7,0. Оптимум активирования приходится нарН 6-7. Если в реакциях индивидуальногоокисления АК фермент ингибируется при рН 6-76-9 молекулами субстрата, то в реакцияхсовместного окисления АК и ГХингибирование ПО возможно двумямолекулами аскорбиновой кислоты.

Катализ для данногофермента определяется сродством его ксубстрату (Chance, 1949), поэтому разные субстратыконкурируют между собой за фермент, и можноожидать, что изменение каталитическиххарактеристик приведет к накоплению илибыстрому окислению биологически активныхвеществ. Поскольку глубина покоя зависитот концентрации ингибиторов роста инизкомолекулярных антиоксидантов,активность ПО оказывает непосредственноевлияние на продолжительность этогофизиологического состояния.

3.3. Антиоксиданты – регуляторыактивности пероксидазы растений

Интерес к механизмудействия ПО вызван еще и тем, чтозначительное накопление фенольныхантиоксидантов в период покоя, а также поддействием стрессовых факторов, приводит кактивации окисления ИУК с участием ПО и кторможению роста. В процессе оксидазногоокисления ИУК образуются супероксиданион-радикал и катион-радикал ИУК,последний в кислой средедекарбоксилируется, превращаясь в радикалскатола (Gazarian etal, 1996;Савицкий и др., 1998). Предложено, что ПОспособна одновременно связывать какперекись скатола, так и молекулу ИУК(Савицкий и др., 1998).

Исследование влиянияИУК на реакции пероксидазного окисления АКпозволило установить, что ауксинингибирует фермент по конкурентному типупри связывании в активном центре ферментаодной молекулы аскорбиновой кислоты. Вреакциях пероксидазного окисления АК сучастием двух и более молекул субстратаИУК проявляла неконкурентный характерингибирования. Связывание ИУК спероксидазой в реакциях конкурентногоингибирования достаточно прочное исоставляет 5,4-20,5 мкМ. В реакцияхнеконкурентного ингибирования ИУКсвязывается с пероксидазой в 3,2-10,2 разалучше, чем связывание второй молекулы АК.При этом величины констант ингибирования вреакциях неконкурентного ингибированияпри рН 4,5-7,0 для ИУК равны 27,3-34,6 мкМ.Известно, что в области связыванияароматических субстратов могутрасполагаться аминокислотные остатки:Arg 38, Phe 142 и 143 (Савицкий идр., 1998). При этом место связывания ИУК можетнаходиться в структуре субдоменаауксин-связывающего участка вблизи Тгр 117,который может принимать участие всвязывании ИУК пероксидазами растений(Аммосова и др., 1997).

Таким образом,используя ИУК можно предположить, чтоучастком связывания АК являетсядистальная область активного центра.Связывание ИУК в этой области при низкихконцентрациях субстрата создаетконкуренцию за участок связывания,проявляемую в реакциях пероксидазногоокисления аскорбиновой кислоты, когда вактивном центре фермента связывается, покрайней мере, одна молекула субстрата. Присвязывании двух и более молекуласкорбиновой кислоты с пероксидазойнаблюдается ускорение реакции окисленияАК, что, вызвано кооперативнымивзаимодействиями между участкамисвязывания этих двух молекулсубстрата.

Изучение реакцийсовместного пероксидазного окисления ОДН,гидрохинона и ферроцианида калия вприсутствии ИУК позволило установить, чтоауксин ингибирует ПО в реакции окисленияОДН по конкурентному типу. В реакцияхокисления гидрохинона при кислыхзначениях рН проявлялся неконкурентныйхарактер ингибирования, переходящий прирН>6,5 в смешанный тип. Присутствие ауксинане влияло на пероксидазное окислениеФК.

Конкурентный типингибирования реакции пероксидазногоокисления о-дианизидина ИУК позволяетпредположить, что ОДН и ИУК связываются водном и том же месте активного центрафермента. При этом связывание ИУКпрепятствует как связыванию, так ипревращению ОДН, тогда как по отношению кгидрохинону тип ингибирования несколькодругой. ИУК и гидрохинон связываются вразличных местах активного центра, однако,если ИУК связывалась на поверхностифермента, то дальнейшее превращениегидрохинона становится невозможным.

Физиологическиймеханизм торможения прорастания зародышасвязан с высоким содержанием ИУК иингибиторов роста. ИУК может регулироватьпероксидазное окисление медленноокисляемого субстрата, имея специфичныйучасток связывания в составе дистальногодомена активного центра ПО. По-видимому,избирательность типов ингибированияпероксидазы ИУК обусловленаспециализированностью ауксина служитьоксидазным субстратом фермента. ИУК можетизменять направленность реакцийпероксидазы с одного типа на другой, меняяспецифичность фермента с пероксидазногона оксидазный, превращая фермент ввысокоспецифичную оксигеназу,генерирующую свободные радикалы,необходимость в которых может возникать урастений в процессе развития. Ауксин можетвыполнять роль "триггера" в реакцияхокисления, катализируемых пероксидазой.Реализация действия ИУК, возможно,проявляется при выходе семян из состояниявынужденного покоя. В этот период в семенахрезко возрастает активность ПО, котораяспособна активировать процессыпрорастания. Возможным механизмомдействия фермента в этих процессах можетбыть его способность к генерированиюсвободных радикалов, необходимых дляактивизации механизмов прорастания.

В экспериментахподробно был изучен механизм влияниянизкомолекулярных регуляторов(салициловой кислоты, витамина К, кверцетин, стероидных глкозидов) на окислениеантиоксидантов – субстратов пероксидазы. Сложностьмеханизмов пероксидазного окислениясубстратов позволяет предположить, чтообласть активного центра ферментаразделена на участки, в которых могутупорядоченно связываться и превращатьсясубстраты. Связывание в регуляторномучастке оказывает влияние на протеканиекаталитического процесса.Последовательное связывание субстратов вэтих участках создает условия дляуправления ферментативным процессом,основанном на принципе корпоративноговзаимодействия субстратов.

Фермент являетсяпоказателем протекания аэробныхметаболических процессов в семенах, а егоактивность увеличивается при ихпрорастании. Понижение активности ПОслужит критерием углубления покоя семян.Поэтому низкомолекулярные АО в высокихконцентрациях понижая активность ПО, могутспособствовать переключению аэробныхметаболических процессов на анаэробные,что будет проявляться в углублении покоясемян и понижении всхожести. Низкиеконцентрации субстратов ПО при ихсовместном присутствии способныактивировать фермент, увеличивая скоростьпротекания аэробных метаболическихпроцессов, обеспечивая переход семян изпокоя в активное состояние, увеличивая ихэнергию прорастания и всхожесть.

4. Влияниеанти- и прооксидантов на всхожесть ифизиолого-биохимические процессысемян

4.1. Влияниенизкомолекулярных антиоксидантов навсхожесть и физиологические процессысемян пшеницы

Нами изучено влияниена всхожесть семян антиоксидантовразличных по строению, являющихсясубстратами гемсодержащей пероксидазы.Обладая разным механизмом действия, они вмалых концентрациях активировалипрорастание семян, а в больших - понижали ихвсхожесть. При этом проявляласьиндивидуальная чувствительность семянпшеницы к используемым соединениям. Низкиеконцентрации строфантина, аскорбиновойкислоты, норадреналина, салицилата натрия,хлорпромазина и этанола повышаливсхожесть семян пшеницы на 15-20%. Тогда каквысокие концентрации исследуемыхсоединений наоборот понижали ихвсхожесть.

В зависимости отстроения антиоксиданты могут регулироватьпротекание метаболических процессов,активировать или ингибировать различныеферменты, влиять на проницаемость мембранклеток. Нет сомнений в том, что наряду сучастием в ингибировании действиясвободных радикалов, антиоксиданты каксоединения, относящиеся к различнымклассам химических веществ, могутпо-разному оказывать существенное влияниена рост и развитие растений.

4.2. Действиеаскорбиновой кислоты и гидрохинона нафизиолого-биохимические процессысемян

Набухание семян в течение 24 ч врастворах АК и ГХ различных концентрацийприводит к понижению их всхожести приодновременном уменьшении активностипероксидазы, которая коррелирует свозрастанием содержания в семенах пшеницыАК и ГХ. Установлена положительнаякорреляция между всхожестью семян иактивностью ПО, которая находится вобратной зависимости от содержания АО всеменах пшеницы. Высокие экзогенныеконцентрации АК и ГХ могут ингибироватьпероксидазу семян пшеницы, понижая ихвсхожесть.

Действие высокихконцентраций АК и ГХ выражается в снижениивсхожести семян пшеницы на 8-15%. Замачиваниесемян в 1 М растворе АК приводило кпонижению активности пероксидазы в корняхи надземной части на 2-е сутки прорастаниядо 30 и 23%, на 3-и - 55 и 45%, на 4-е - 55 и 70%, а на 6-е - 62и 87% соответственно. Набухание семянпшеницы в растворах 50 мМ гидрохинонаснижало активность пероксидазы в корнях инадземной части проростков на 2-е суткипрорастания до 15 и 10%, на 3-и - 20 и 17%, на 4-е -27 и19%, а на 6-е - 45 и 42% соответственно. Тогда какнабухание семян пшеницы в растворах низкихконцентраций АК и ГХ практически не влиялона активность пероксидазы в семенах.

Пероксидаза,алкогольдегидрогеназа иглюкозо-6-фосфатдегидрогеназа играютважную роль в покое и прорастании семянпшеницы. В прорастающих семенах активностьпероксидазы возрастает, а активность АДГснижается. У непроросших семян активностьАДГ повышается в 2,5-5,5 раза, при пониженииактивности пероксидазы в 2,8-3,5 раза посравнению с прорастающими семенами.Высокая разница в величинах активностиферментов указывает на разную степень ихучастия в механизмах прорастания семянпшеницы. Показано, что независимо отконцентрации используемых антиоксидантовактивность АДГ и Г6ФДГ в семенахпрактически не изменялась после 24 чзамачивания их в растворах АК и ГХ.

Выполненныеисследования по изучению эндогенногосодержания АК в сухих и набухших семенахподтверждают участие аскорбиновой кислотыв регулировании покоя. Показано, что АК внепроросших семенах пшеницы на протяжениивсего срока прорастания сохраняется навысоком уровне, что в 1,5-1,8 раз выше, чем всухих семенах. Отмечается явная тенденцияк понижению содержания АК в проклюнувшихсясеменах и в проростках пшеницы посравнению с уровнем этого антиоксиданта внепроросших семенах. На четвертые суткипрорастания в надземной части и корняхпроростков пшеницы уровень АК понижается в4 раза. Эти изменения в содержании АК могутслужить подтверждением участия эндогенныхантиоксидантов в формировании механизмовпокоя семян пшеницы.

Таким образом,понижение активности пероксидазы высокимиконцентрациями АО способствует углублениюпокоя семян, а активирование фермента -ускоренному их выходу из состояния покоя ибыстрому прорастанию. Насыщая зернорегуляторами, можно добиваться повышенияпосевных качеств, а также сопротивляемостисемян и растений к экзогеннымнеблагоприятным факторам. Обработка семянпшеницы биологически активными веществамив течение первых двух часов будетспособствовать повышению их всхожести.

4.3. Влияниерастительного гликозида на всхожесть ифизиологические процессы семян

Замачивание ипроращивание семян проводили в растворахстрофантина 0,025 - 250 мкг/мл. Из опытовследует, что строфантин может избирательновлиять на всхожесть и рост вегетативноймассы проростков. Высокие концентрациистрофантина оказывают сильное угнетающеедействие на всхожесть семян овса икараганы независимо от условийзамачивания и проращивания. Тогда как этиже концентрации строфантина на семенаячменя Неван и пшеницы сортов Скороспелкаи Якутянка 224 оказывают стимулирующеедействие.

Малые дозыстрофантина (2,5-0,025 мкг/мл) на семена всехвидов оказывали преимущественностимулирующее действие, повышая всхожестьна 15-30% и увеличивая вегетативную массупроростков. Причем следует отметить, чтокак ингибирующий, так и активирующийэффекты строфантина проявляются особенносильно при предварительном замачиваниисемян в растворе. Для семян овса и караганыпри замачивании и проращивании в растворестрофантина отмечается ингибирующийэффект, который аддитивно возрастает, еслиэти два действия производятсяпоследовательно. Активация всхожестисемян малыми дозами строфантинанаблюдалась, в основном, если семенапроращивались в растворе.

Таким образом,действие строфантина в отношении семянспецифично и избирательно в зависимости отвида растения. Накопление СГ в семенахячменя и пшеницы может активироватьскорость протекания метаболическихпроцессов, способствуя выходу их изсостояния гипобиоза. Для семян овса икараганы такое повышение гликозидовнаоборот приводит к снижению уровняметаболизма и углублению покоя.

4.4. Участие аскорбиновойкислоты и растительных гликозидов вформировании гипобиотического состояниясемян

Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |   ...   | 9 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»