WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Becton Dickinson, USA

PE

8.

CD95L, FasL

Alf-2.1

CALTAG Laboratories, USA

PE

9.

Recombinant

Annexin V

-

CALTAG Laboratories, USA

FITC

10.

Propidium Iodid

-

CALTAG Laboratories, USA

PE

11.

Мышиные IgG1

-

Becton Dickinson

FIFC

12.

Мышиные IgG2a

-

Becton Dickinson

PE

Аннексиновый тест. Для определения количества клеток, вступивших в апоптоз, проводили тест с одновременным окрашиванием клеток Annexin V и пропидиумом иодидом (PI). Для этого к 50 мкл суспензии клеток добавляли 5 мкл Annexin V, коньюгированного с FITC, и 10 мкл PI, коньюгированного с РЕ, инкубировали 15 мин в темноте, затем добавляли 200 мкл стабилизирующего буфера (CALTAG Laboratories, США), и не более, чем в течение 30 мин. анализировали на проточном цитометре.

Результаты работы и их обсуждение

У детей 3-14 лет была диагностирована как локализованная, так и генерализованная формы ЛАП, но генерализованная ЛАП достоверно чаще выявлялась у детей младшего возраста по сравнению с таковой у детей старшего возраста (р<0,05), что, по-видимому, объясняется незрелостью иммунной системы у детей раннего возраста, проявляющейся в склонности к генерализации инфекции [Демихов В.Г., 2002]. У подавляющего большинства больных выявлялись множественные ЛУ 5 и 6 степени увеличения (до 3,0 см). с вовлечением в патологический процесс одновременно до 8 групп ЛУ, но в младшем возрасте по сравнению с детьми более старшего возраста достоверно чаще выявлялось одновременное увеличение 5 групп ЛУ (р<0,05). Одинаково часто, независимо от возраста, у детей с ЛАП выявлялись подчелюстные, передне-шейные, задне-шейные и аксиллярные ЛУ, а у детей младшего возраста, кроме вышеперечисленных, еще и паховые ЛУ (р<0,01). Полученные результаты согласуются с литературными данными о состоянии ЛУ при герпес-вирусных инфекциях [Баранов А.А. и др., 1998]. На момент госпитализации у детей с ЛАП отмечались субфебрильная температура, гиперемия зева, гипертрофия миндалин, затруднение носового дыхания, гепатомегалия. Состояние средней тяжести, интоксикация, аденоиды и спленомегалия достоверно чаще диагностировались в младшей возрастной группе (р<0,05, р<0,01, р<0,001, р<0,05 соответственно). Дети с ЛАП всех трех возрастных групп были сопоставимы по анамнестическим данным, а также по наличию острой и хронической сопутствующей патологии. Значительная часть детей с ЛАП 3-14 лет относилась к группе ЧБД.

Исследование инфекционного фона выявило крайне низкое содержание АТ класса IgM ко всем исследуемым инфекциям, как у детей с ЛАП 3-14 лет, так и у детей контрольной группы соответствующего возраста (р>0,05 во всех случаях), за исключением более частого выявления IgM-VCA АТ к VEB у детей с ЛАП в возрасте 3-6 лет (р<0,05). Это предполагает наличие активной вирусной инфекции у детей с ЛАП в раннем возрасте и согласуется с клиническими и литературными данными [Иванова В.В. и др., 2001]. Частота выявляемости IgG АТ к HSV, CMV, IgG-NA АТ к VEB была достаточно высокой во всех исследуемых группах (р>0,05 во всех случаях), что согласуется с данными литературы о высокой распространенности герпес-вирусных инфекций [Шульженко А.Е., 2005]. Следует отметить, что у детей с ЛАП 3-14 лет достоверно чаще, чем в контрольной группе, одновременно выявлялись маркеры трех инфекций (р<0,01). Вирусные ассоциации, включающие все 3 вида герпетической инфекции, выявлялись достоверно чаще у детей с ЛАП 3-14 лет, чем у здоровых детей (р<0,05). Имеются литературные данные о наличии герпетической микст-инфекции у детей с ЛАП, но они крайне малочисленны [Корсакова И.И. и др., 2004; Sawanobori M.,et al., 1997]. Данный факт может свидетельствовать о возможной реактивации герпес-вирусов в связи с недавно перенесенной острой инфекцией. Это согласуется с данными других исследователей [Краснова Е.А. и др., 2004] и подтверждается анамнестическими данными: у подавляющего большинства детей с ЛАП 3-14 лет за период от 2 недель до 2 месяцев перед госпитализацией была диагностирована ОРВИ.

Нами не было выявлено достоверных различий в частоте встречаемости маркеров бактериальной инфекции у обследованных детей (р>0,05 во всех случаях). По-видимому, в генезе формирования ЛАП именно вирусная инфекция играет определяющую роль. Это согласуется с литературными данными о ведущей роли ЛАП в клинике герпес-вирусных заболеваний [Ратманова Г.А. и др., 2002; Sanchez Echaniz J. et al., 1996; Shizuma T., 2005].

Клетки с цитотоксической активностью играют ведущую роль в противовирусном иммунитете [Серебряная Н.Б. и др., 2007], однако данные по цитотоксическому ответу у детей с ЛАП немногочисленны. Нами было предпринято определение популяций Т-лимфоцитов с цитотоксической активностью (CD8, CD8, T), экспрессии маркеров Fas, Fas-L, CD45RO, CD45RA на поверхности лимфоцитов периферической крови и CD8+ клеток, а также определения особенностей апоптоза лимфоцитов. Данные приведены в таблице №2.

Полученные результаты показали, что у детей с ЛАП старше 6 лет было достоверно выше, чем у здоровых детей, количество CD8+ лимфоцитов (р<0,05, р<0,001 соответственно), а у детей с ЛАП младше 6 лет отмечалась тенденция к их увеличению (р>0,05). Данные по содержанию CD8+ Т-клеток при герпетической инфекции противоречивы и свидетельствуют как об увеличении количества CD8+ Т-клеток [Малышева О.А. и др., 2001; Silins S.I., et al., 1997], так и об уменьшении их количества и функциональной активности [Краснов В.В., 2003; Пичугина Л.В., 2006]. Некоторые авторы отмечают отсутствие количественных изменений в содержании CD8+ лимфоцитов при вирусной инфекции [Марданлы С.Г. и др., 2005], но при этом они наблюдали снижение специфической Т-клеточной цитотоксичности. Вероятно, сочетанная герпес-вирусная инфекция является причинно-значимым фактором повышения количества CD8+ ЦТЛ в периферической крови детей с ЛАП старше 6 лет. Отсутствие достоверного повышения уровня ЦТЛ в крови детей с ЛАП младше 6 лет может объясняться дефицитом клеточного иммунитета в связи с незрелостью иммунной системы [Кузьменко Л.Г. и др., 1999], а также тем, что для накопления достаточного количества клонов специфических ЦТЛ требуется определенное время, поэтому их уровень при острой инфекции достигает своего максимума к началу периода выздоровления [А.А. Ярилин, 1999]. При инфекциях продолжительная поликлональная стимуляция может приводить к ослаблению функции ЦТЛ, истощению и иммуносупрессии [Андросова М.В. и др., 2007], то есть иммунологической недостаточности, которая может обуславливать высокую частоту ОРВИ у детей с ЛАП. Можно предположить, что в патогенезе ЛАП у детей старше 6 лет ведущую роль играет хроническая, персистирующая или рецидивирующая вирусная инфекция, а у детей младше 6 лет - преимущественно острая вирусная инфекция.

CD8+ лимфоциты, специфичные в отношении вирусных инфекций, делятся на наивные, клетки памяти и эффекторные ЦТЛ, которые характеризуются различной экспрессией изотипов CD45 [Chen G., et al., 2001]. На поверхности наивных Т-клеток экспрессируется изоформа CD45RA, а на зрелых эффекторных клетках и клетках памяти – CD45RO [А.А. Ярилин, 1999]. У детей с ЛАП 3-14 лет было достоверно выше, чем у здоровых детей, количество коммитированных ЦТЛ с фенотипом CD8+CD45RO+. У детей старшей возрастной группы, помимо этого, было выше, чем в контрольной группе, и количество наивных ЦТЛ с фенотипом CD8+CD45RА+. У детей средней возрастной группы дополнительно был выше уровень наивных и коммитированных лимфоцитов. Мы предполагаем, что в младшей и старшей возрастных группах отсутствие повышения уровня коммитированных лимфоцитов в крови может быть связано со снижением количества CD4+ клеток, которое, по литературным данным, наблюдается при острой [Родионова О.В. и др.; 2000; Краснов В.В., 2003], хронической [Редькин Ю.В. и др., 2006; Laurence J. et al., 1993] и михт-инфекции [Корсакова И.И. и др., 2004]. Однако по современным данным реэкспрессия CD45RA может наблюдаться и в популяции эффекторных клеток и клеток памяти [Rufer N. et al., 2003; Dunne P.J. et al., 2005]. В связи с этим повышение у детей с ЛАП старшего возраста количества ЦТЛ с фенотипом CD8+CD45RA+ можно объяснить повышением содержания вирус-специфичных клеток памяти и, вероятно, эффекторов с промежуточными функциональными свойствами. Нами установлено, что при соотношении CD45RA+/CD45RO+ лимфоцитов равном или большем 2,5 можно прогнозировать частые ОРВИ у детей с ЛАП с точностью 82,6% (Патент №2317549 от 20.02.2008).

Специфический противоинфекционный ответ требует определенного времени, в то время как цитотоксическая реакция + Т-клеток является ранним фактором защиты [Carding S.R., et al., 2002]. Нами было показано, что уровень + Т-клеток в крови у детей с ЛАП был повышен только в возрасте 3-6 лет (р<0,05), что может быть обусловлено повышенной частотой острой вирусной инфекции у детей в этом возрасте. Высокий уровень + Т-клеток в крови у детей с ЛАП младшего возраста, кроме того, может объяснять отсутствие повышения у них уровня CD8+ ЦТЛ, поскольку Т+ клетки продуцируют цитокины IL-10 и TGF с ингибирующим действием [Carding S.R., et al., 2002]. Увеличение количества лимфоцитов с TCR типа у детей с ЛАП согласуется с литературными данными, подтверждающими роль клеток с TCR типа в противовирусном ответе [Hou S., et al., 1992; Carding S.R., et al., 2002].

Недавно была обнаружена популяция CD8+ Т-клеток, экспрессирующих TCR типа [Shao L., et al, 2005]. Этот пул лимфоцитов активируется неклассическими HLA молекулами 1 класса CD1d в сочетании с костимуляторными молекулами, принадлежащими к семейству карциноэмбриональных антигенов. В настоящее время считается доказанным, что CD8+ клетки обладают регуляторными функциями, поддерживают иммунологическую толерантность, участвуют в подавлении чрезмерного иммунного ответа на его заключительных стадиях [Maloy K.J., et al., 2001]. Проведенные нами исследования показали, что у детей с ЛАП 3-11 лет в отличие от здоровых детей отмечалась тенденция к повышению уровня CD8+ лимфоцитов в крови, которая становилась достоверной в старшей возрастной группе (р<0,01). Мы можем предположить, что у детей с ЛАП этого возраста экспансия CD8+ клеток, которая наблюдалась на фоне одновременного повышения уровня CD8+ ЦТЛ, максимально выраженного в возрасте 12-14 лет, может быть адаптивной реакцией для того, чтобы ограничить иммунный ответ и избежать развития тяжелых воспалительных и аутоиммунных процессов.

В патогенезе инфекционных заболеваний важную роль играют нарушения апоптоза [Strater J., et al., 2004; Dunne P.J., et al., 2002]. Проведенные нами исследования позволили уточнить основные параметры Fas-зависимого апоптоза лимфоцитов у детей с ЛАП. У всех детей с ЛАП, независимо от возраста, наблюдалось более низкое, чем у здоровых детей, содержание лимфоцитов, экспрессирующих FasL (р<0,05 во всех случаях), а у детей младшего возраста дополнительно – снижение числа лимфоцитов экспрессирующих Fas (р<0,01). У детей с ЛАП старше 6 лет в популяции ЦТЛ достоверно повышалось содержание клеток, экспрессирующих Fas (р<0,001, р<0,05 соответственно), и отмечалась тенденция к их повышению у детей младше 6 лет (р>0,05). Учитывая, что FasL, экспрессирующийся на мембране киллеров, обуславливает индукцию апоптоза клеток-мишеней, экспрессирующих рецептор Fas [Ярилин А.А., 1999], можно сделать вывод, что у детей с ЛАП индукция апоптоза и следующая за ней реализация апоптоза лимфоцитов должна быть нарушена во всех возрастных группах, и особенно в младшей возрастной группе. Это может быть связано со способностью вирусов герпетической группы блокировать апоптоз [Strater J., et al., 2004]. В то же время в популяции CD8+ лимфоцитов экспрессия FasL не отличалась от таковой у детей контрольной группы, в связи с чем можно предположить, что апоптоз-индуцирующая функция ЦТЛ у детей с ЛАП остается не нарушенной. У детей с ЛАП старше 6 лет наблюдалось увеличение количества ЦТЛ, экспрессирующих Fas молекулу, что позволяет предполагать их повышенную готовность к апоптозу.

Изучение параметров аннексинового теста показало, что у детей с ЛАП 3-14 лет в периферической крови во все возрастные периоды отмечалось увеличение количества лимфоцитов на ранних этапах апоптоза с фенотипом Ann+Pi- (р<0,05, р<0,001, р<0,001 соответственно) при одновременном снижении уровня клеток, находящихся на поздних его этапах, с фенотипом Ann+Pi+ (р<0,05 во всех случаях); в возрасте 12-14 лет, кроме этого, у детей с ЛАП возрастало число лимфоцитов, вступивших в апоптоз (Ann+) (р<0,001).

Таблица 2. Сравнительная характеристика содержания клеток с цитотоксической активностью, Fas и FasL позитивных лимфоцитов и параметров апоптоза у детей с ЛАП в возрасте 3-14 лет

Показатель, %

3-6 лет

n=24

7-11 лет

n=15

12-14 лет

n=20

CD45RA+

62,70±3,25

62,27±3,54**

66,94±3,43

CD45RO+

26,85±1,50

25,08±2,29*

27,70±1,41

CD8+

21,37±1,20

20,03±1,23*

22,61±1,30***

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»