WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

УДК 575.22:577.113:575.174.015.3:595.773.4

ВАУЛИН ОЛЕГ ВИКТОРОВИЧ

Генетический полиморфизм мультилокусных маркеров и генных последовательностей ДНК в природных популяциях Drosophila melanogaster Северной Евразии

03.00.15 – генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск 2008

Работа выполнена в Лаборатории генетики популяций

Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Захаров Илья Кузьмич

Институт цитологии и генетики СО РАН,

г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Бугров Александр Геннадьевич

доктор биологических наук, профессор

Серов Олег Леонидович

Ведущее учреждение: Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН,

г. Москва

Защита диссертации состоится ___ ________ 2008 года на утреннем заседании диссертационного совета Д-003.011.01 в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу:

проспект акад. Лаврентьева 10, г. Новосибирск, 630090.

тел/факс: (383)3331278, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан _____ _________ 2008 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук А.Д. Груздев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Генетический полиморфизм является необходимым предметом изучения для эволюционных и экологических построений. С одной стороны, полиморфизм позволяет охарактеризовать адаптационные возможности популяций по отношению к абиотическим, биотическим или антропогенным факторам. С другой стороны, генетическое разнообразие предопределяется историей вида, а так же особенностями его биологии и расселения. На все популяции любого вида действуют в различной степени факторы эволюции: отбор, мутационный и миграционный процессы, а так же – дрейф генов. Их эффективность действия на генотипическую структуру популяций может варьировать в широких пределах. Ответы различных функциональных участков генома (структурные и регуляторные гены, повторённые последовательности и мобильные генетические элементы, эу- и гетерохроматиновые, прицентромерные и теломерные районы хромосом и т.д.) также могут иметь свою специфичность.

В связи со спецификой действия различных факторов эволюции на генетический полиморфизм по разным локусам, полную картину генетического разнообразия в популяциях можно получить только при объединении результатов, полученных с помощью различных методов и подходов.

Генетический полиморфизм в природных популяциях Drosophila melanogaster хорошо и разносторонне изучен на значительных участках ареала. В частности, полиморфизм ДНК по различным маркерам (уникальные последовательности, микросателлиты) в высокой степени изучен в популяциях Африки, Западной Европы и Юго-Восточной Азии и Северной Америки этого вида (Goldstein, Clarc, 1995; Veuille et al., 1998; Andolfatto, Przeworski, 2001; Caracristi, Schltterer, 2003; Sawyer et al., 2006). Популяции Drosophila melanogaster России и ближнего зарубежья, будучи изученными на предмет видимых и рецессивных летальных мутаций, мобильных элементов и эндосимбионтов (Дубинин и др., 1936; Берг и др., 1941; Голубовский., 1970а; Zakharenko et al., 2000; Илинский, Захаров, 2007a, б), оставались фрагментарно исследованными в отношении полиморфизма ДНК. Изучение полиморфизма ДНК и его динамики в этих популяциях представляется актуальной задачей, так как дополняет и расширяет представления о генетическом разнообразии, микроэволюции, расселении и биологии Drosophila melanogaster на обширной части ареала вида.

Цель и задачи работы

Целью исследования является получить оценку генетического разнообразия - полиморфизма мультилокусных маркеров и генных последовательностей ДНК, и дать характеристику пространственной и временной динамики генетической изменчивости в природных популяциях Drosophila melanogaster Северной Евразии.

Были поставлены следующие задачи:

  1. Охарактеризовать изменчивость геномной ДНК в географически удалённых популяциях Drosophila melanogaster России и Украины с помощью анонимных маркеров RAPD-PCR.
  2. Изучить внутрипопуляционную динамику геномной ДНК в популяции Drosophila melanogaster г. Умань (Украина) за 20-летний период (1984-2004 гг.) методом анонимных маркеров ДНК ISSR-PCR.
  3. Описать изменчивость нуклеотидных последовательностей фрагментов гена алкогольдегидрогеназы (Adh) и интрона 1 гена yellow в североевразийских популяциях Drosophila melanogaster.

Научная новизна работы. В ходе данной работы впервые была описана изменчивость геномов ряда североевразийских популяций Drosophila melanogaster методами мультилокусных маркеров ДНК – RAPD и ISSR. Динамика генетической изменчивости была оценена за период двух десятилетий. Описан ряд популяционно-генетических характеристик (средняя гетерозиготность, генетические расстояния, потоки генов), которые нельзя было получить ранее по результатам изучения фенотипических маркеров или рецессивных летальных мутаций. Впервые для североевразийских популяций Drosophila melanogaster охарактеризована нуклеотидная изменчивость фрагмента гена алкогольдегидрогеназы (Adh) и фрагмента интрона 1 гена yellow. Показаны особенности изменчивости этих фрагментов ДНК в изученных нами популяциях по отношению к популяциям из других частей ареала Drosophila melanogaster.

Положения, выносимые на защиту

1. Основными факторами, определяющими изменчивость некодирующей ДНК в североевразийских популяциях Drosophila melanogaster, являются дрейф генов и миграция.

2. Североевразйские популяции Drosophila melanogaster имеют отличительные особенности по сравнению с популяциями из других областей ареала по представленности вариантов нуклеотидных последовательностей генов.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты расширяют представления об изменчивости генома в популяциях Drosophila melanogaster. Эти данные могут иметь значение для характеристики микроэволюционных процессов в популяциях синантропных видов.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на: 4-й Общероссийской межвузовской конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Наука и образование» (Томск, 2002); 41-й Международной научной студенческой конференции “Студент и научно-технический прогресс” (Новосибирск, НГУ, 2003); 3-м съезде ВОГиС (Москва, 2004); 10-й Пущинской школе-конференции молодых учёных, посвященной 50-летию Пущинского НЦ РАН (Пущино, 2006); конференции «Современные проблемы биологической эволюции», посвященной 100-летию Государственного Дарвиновского музея (Москва, 2007); международной конференции «Развитие эволюционной идеи в биологии, социологии и медицине», посвященной 90-летию со дня рождения академика Д.К. Беляева (Новосибирск, 2007); отчётных конференциях «Динамика генофондов растений, животных и человека» (Москва, 2005, 2006, 2007); отчётной сессии Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск, 2006).

Публикации

Материалы по теме диссертации опубликованы в 19 работах, из них 6 статей опубликованы в научных журналах, в которых по требованию ВАК Минобрнауки России должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание учёной степени доктора и кандидата наук по биологическим наукам.

Структура и объём диссертации

Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы и список литературы. Работа изложена на 132 страницах, включает 12 рисунков и 12 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Изучали природные популяции Drosophila melanogaster, представленные в фонде лаборатории генетики популяций ИЦиГ СО РАН в виде изосамочьих линий. Изосамочья линия представляет собой потомство одной оплодотворённой в природе самки и которое поддерживается в ряду поколений простым размножением без проведения какого-либо искусственного отбора в фонде лаборатории. В зависимости от года выделения линии она содержалась в лабораторных условиях от нескольких месяцев до 20 лет.

С целью изучения межпопуляционного разнообразия D. melanogaster методом RAPD-PCR использовали образцы ДНК самок, происходящих из 5 популяций: Россия: п. Чемал 2003 г. (Республика Алтай), г. Ижевск 2002 г. (Удмуртия); Украина: г. Звенигородка г. Никополь и г. Умань – все 2003 г.

Для анализа временнй динамики в популяции D. melanogaster г. Умань использовался метод ISSR-PCR. Анализировали выборки 1984, 1988, 1990, 1991, 2003 и 2004 годов. При изучении пространственной и временнй изменчивости ДНК исследовали более десятка образцов из каждой популяции. Для анализа по изменчивости нуклеотидной последовательности фрагмента гена Adh длиной 482 п.н. брали по 4-6 линий из выборок: Умань 1984 и 1993 гг., Никополь 1997г., Бийск 1993 г., Белокуриха 2000 г., Горно-Алтайск 1993 г., Сочи 2004 г., Ижевск 2002 г., Нальчик 2006 г., Бишкек 2004 г., Каракол 2006 г. Изучение изменчивости нуклеотидной последовательности фрагмента интрона гена yellow длиной 400 п.н. проводили по 1-5 линиям из тех же выборок (за исключением Белокуриха 2000 г.).

Выделение ДНК проводили индивидуально из каждой мухи по стандартной методике с модификациями (Bender et al., 1983). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в реакционной смеси объёмом 25 мкл. На одну реакцию во всех случаях брали по 1 мкл исходного раствора ДНК. Использованные для работы праймеры приведены в табл. 1.

ПЦР-продукты разделяли электрофорезом в агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. Для продуктов ПЦР уникальных последовательностей, RAPD и ISSR и использовали 1, 1,5 и 2 %-гель, соответственно.

Для мультилокусных маркеров электрофореграммы (Рис. 1) фотографировали в ультрафиолетовом свете. Анализ электрофореграмм проводили визуально.

Таблица 1. Праймеры, использованные в работе.

Метод исследования

Название

праймера

Последовательность праймера

RAPD-PCR

П1

5’-CCCAG-CTGTG-3’

П2

5’-CTCCC-TGCAG-3’

П3

5’-GACGG-ATCAG-3’

ISSR-PCR

(AG)8G

5’-AGAGA-GAGAG-AGAGA-GG-3’

(CT)8A

5’-CTCTC-TCTCT-CTCTC-TA-3’

(CA)8G

5’-CACAC-ACACA-CACAC-AG-3’

Секвенирование фрагмента гена yellow*

Forward

5’-GTTGC-GAGGT-TTTAG-GACTG-A-3’

Reverse

5’-CAATG-GTAAC-TGCCG-TGCTA-A-3’

Секвенирование фрагмента гена Adh

Forward

5’-ATTGC-CGTCA-ACTAC-ACTGG-3

Reverse

5’-GGTTC-GCGAA-CCCTA-TGAAC -3’

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Рис 1. Электрофоретический спектр ДНК D. melanogaster из популяции Умань разных лет, амплифицированной с помощью праймера (AG)8G. Дорожки: 1-3 –2004 г.; 4, 5, 7 – 1990 г.; 8, 9 – 2003 г.; 10, 11 – 1991 г.; 13, 14 – 1984 г.; 15-16 –1988 г.; 6 и 12 несут маркёры молекулярных масс  HindIII и 100 bp +1,5 kb; 17 – негативный контроль.

ПЦР-продукты фрагментов генов yellow и Adh секвенировали с помощью реактива Big Dye 3.1. Сиквенсный форез проводили в Межинститутском центре секвенирования ДНК СО РАН.

Для мультилокусных маркеров оценивали среднее, минимальное и максимальное число фракций ДНК, амплифицированных с участием каждого праймера, на особь в выборке, общее число фракций ДНК в выборке, число мономорфных фракций, долю полиморфных фракций ДНК в выборке, среднюю гетерозиготность фракций ДНК в выборке.

Степень генетической дифференциации популяций оценивали, используя меры DNei (Nei, 1972) и GD (Link et al., 1995). Для расчёта DNei и оценки потока генов (через меру Gst) использовался пакет программ POPGENE (Yeh et al., 1999).

Для выявленных в ходе работы вариантов последовательности фрагментов генов yellow и Adh, проведено сравнение с таковыми, опубликованными в базе данных ДНК DDBJ (http://www.ddbj.nig.ac.jp/). В случае с фрагментом гена yellow рассматривались последовательности: AC104286, AL023873, X04427, X04703, AF345767, AF345768, AF345769, AF345770, AF345771, AF345772, AF345773, AF345774, AF345775, AF345776, AF345777 и AF345778. Для гена Adh было проведено сравнение с последовательностями: M22210, M17827, M17828, M17830, M17831, M17832, M17833, M17834, M17835, M17836, M17837 M19547, M36580, X04454, X60791, X60792, X60793 и U20765. Выявленные в ходе работы разные варианты последовательности ДНК, соответствующие S-форме Adh, были обозначены нами как S1, S2, S3. Единственный вариант F-формы Adh маркировался как F.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Особенности генетической изменчивости в популяциях Drosophila melanogaster северной Евразии, выявляемой методом RAPD-PCR

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»