WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |

Для тестирования субпопуляций лимфоцитов применяли метод иммуноцитохимии с использованием моноклональных антител для дифференцировочных и активационных антигенов СD3, CD4, CD8, CD16, CD22, CD25, CD95, HLA-DR («DAKO», «Novocastra»). Концентрацию сывороточных иммуноглобулинов: IgG, IgM, IgA определяли методом радиальной иммунодиффузии в геле по Манчини (Mancini et al., 1965). Функциональную активность нейтрофилов определяли по их способности генерировать активные формы кислорода в реакции восстановления нитросинего тетразолия (Нестерова И.В. с соавт., 1999). ИМ получали и обрабатывали согласно рекомендациям Института пульмонологии (1998). При помощи иммерсионной микроскопии на 400 клеток мазка подсчитывали процентное соотношение плазматических клеток, лимфоцитов, нейтрофилов, макрофагов, и эозинофилов, не учитывая клетки плоского и бронхиального эпителия. Содержание фактора некроза опухоли- (ФНО-), интерферона- (ИНФ-), интерлейкинов 4, 2, 8 и 10 (ИЛ-4, ИЛ-2, ИЛ-8 и ИЛ-10) в ИМ определяли иммуноферментным методом с использованием наборов реагентов «ИФА-TNF-alpha» и «ИФА-IL-10» (ГНЦ НИИ особо чистых биопрепаратов, Санкт-Петербург), «гамма-Интерферон-ИФА-БЕСТ» и «ИЛ8-ИФА-БЕСТ» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск), «Human IL2 ELISA BMS221INST» («Bender MedSystems», Австрия), «ИЛ-4-ИФА-БЕСТ» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск).

Статистическая обработка материала проводилась с использованием пакета прикладных программ «Statistica for Windows 6.0». Выборки данных проверяли на нормальность распределения (критерий Колмогорова-Смирнова). При соответствии нормальному закону распределения признака в исследуемых выборках проверку гипотезы о равенстве средних выборочных величин проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Для оценки статистической значимости различий показателей выборок, не подчиняющихся закону нормального распределения, использовали непараметрический критерий Манна-Уитни (U-тест). С целью обнаружения связи между исследуемыми показателями проводили корреляционный анализ путем вычисления коэффициента ранговой корреляции Спирмена (r). Коэффициент корреляции считали значимым, если вероятность ошибки не превышала 0,05. При сравнении частот генотипов использовался стандартный критерий 2 Пирсона, при условии, когда объем выборки не превышал 5 случаев, использовали критерий 2 с поправкой Йетса и критерий Фишера. Подсчитывали отношение шансов (OR - odd ratio) для оценки ассоциации между определенными генотипами и риском развития заболевания по стандартной формуле OR=a/b x d/c, где a и b – количество больных, имеющих и не имеющих мутантный генотип, соответственно, и d и с – количество человек в контрольной группе, имеющих и не имеющих мутантный генотип. OR указан с 95%-ным доверительным интервалом (Confidence interval CI) (Лакин Г.Ф., 1989; Дж. Флейс, 1989). Для всех изученных полиморфных вариантов генов в выборках популяционного контроля и пациентов распределение генотипов соответствовало ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Мультифакториальный характер аллергических заболеваний и злокачественных новообразований предполагает определенную генетическую детерминированность функционирования патогенетически важных звеньев, связанных с обеспечением взаимодействия с ксенобиотиками, поддержания целостности генома и функционирования иммунной системы. Возникновение изменений в структуре ДНК, приводящих при определенных условиях к злокачественной трансформации эпителия, напрямую зависит от интенсивности воздействия мутагенов внешней среды и генотоксических агентов эндогенного происхождения, что, в свою очередь, определяется эффективностью работы систем контроля стабильности генома и ферментативной детоксикации, в соответствии генетическими особенностями индивидуума (Palli et al., 2004; Yokota & Kohno, 2004).

Результаты осуществленного нами генотипирования генов ФБК 2 фазы, которые обеспечивают инактивацию генотоксических агентов, у больных, ХОБЛ и БА, а также РЛ (данные П.А.Гервас, 2006) представлены на диаграмме (рис.1).

У больных ХОБЛ мы не выявили значимых отличий в распределении генотипов генов GSTT1 и сочетаний GSTT1 и GSTM1 от контрольной выборки, при этом частота нулевого генотипа гена GSTT1 была существенно ниже, чем у больных РЛ. Частота нефункционального генотипа GSTM1”0/0” как в общей группе, так и среди курящих пациентов с ХОБЛ была значимо повышена по сравнению с контролем и не отличалась от таковой в группе больных РЛ. Литературные сведения свидетельствуют об отсутствии ассоциации нулевого генотипа гена GSTT1с ХОБЛ в большинстве популяций (Д.Г.Янбаева и соавт., 2005, Yim et al., 2000). Наши результаты об ассоциации «нулевого» генотипа GSTM1 с риском заболевания ХОБЛ согласуются с данными для европеоидов Великобритании и Франции (H. Baranova et al., 1997; D.J. Harrison et al., 1997), а также для Тайваньской популяции (S.L. Cheng et al., 2004), однако находятся в противоречии с данными Д.Г.Янбаевой и соавт., (2005), полученными на более представительной (240 человек) выборке жителей России.

Ассоциация генотипа GSTM1”0/0” с ХОБЛ и РЛ свидетельствует об общих патогенетических механизмах формирования этих заболеваний и о наличии определенной генетической предрасположенности пациентов с ХОБЛ к формированию РЛ.

В общей группе БА показано существенное повышение частоты встречаемости нулевых генотипов гена GSTT1 и сочетания генотипов GSTT1 и GSTM1 по сравнению с популяционным контролем (рис.1). Известно, что для истинно атопической астмы характерно раннее начало заболевания (до 40 лет), а в группе больных БА с дебютом после 40 лет преобладают пациенты со смешанным механизмом формирования заболевания. Также есть литературные данные о различиях распределения вариантных аллелей генов ФБК и хемокинового рецептора CCR5 у больных бронхиальной астмой разных возрастных групп (С.И. Макарова и соавт., 2002; Srivastava et al, 2003). Поэтому мы сочли целесообразным оценить полиморфизм генов GSTT1 и GSTM1 раздельно в вышеозначенных группах больных БА. Оказалось, что в группе с превалированием пациентов с астмой смешанного генеза частота генотипа GSTM1”0/0” сравнима с таковой в группе больных РЛ и значительно выше, чем у больных БА с манифестацией заболевания в молодом возрасте (атопическая БА), у которых этот показатель не отличается от контрольного уровня.

Поскольку курение является ведущим этиологическим фактором развития РЛ, мы провели анализ частот генотипов генов GSTT1 и GSTM1 у курящих больных БА и ХОБЛ, соответствующих по половому и возрастному составу, в сравнении с группой больных РЛ. Оказалось, что ассоциация генотипа GSTM1”0/0” с повышенным риском заболевания ХОБЛ наблюдается только для курящих лиц. Это свидетельствует о модифицирующем влиянии курения у носителей генотипов GSTM1”0/0” на предрасположенность к ХОБЛ, а также указывает на более высокий риск заболевания РЛ курящих пациентов с ХОБЛ. Такой зависимости от курения у больных БА не выявлено.

Наши данные о повышении частоты нулевых генотипов генов глутатион-S-трансфераз GSTT1, GSTM1 у больных БА не противоречат литературным сведениям (Ляхович В.В. и соавт., 2000; Иващенко Т.Э. и соавт., 2001). В этиологии БА значимая роль придается загрязнению окружающей среды ксенобиотиками, в том числе и токсическими веществами, которые снижают барьерную функцию кожи и слизистых; при этом многие ксенобиотики сами являются аллергенами или гаптенами либо приобретают свойства аллергенов после ферментативной биотрансформации in vivo (Казначеева Л.Ф. и соавт., 2002). Оказалось, что курение матери во время беременности и пассивное курение является фактором риска формирования БА у детей (Gilliland et al., 2002; Kabesch et al., 2004). Хотя показано, что активное курение не влияет на риск развития заболевания у взрослых, однако оно способствует более тяжелому течению астмы (Siroux et al., 2000).

Согласно нашим данным, рисковая значимость GSTM1”0/0” для формирования БА повышается с возрастом, что согласуется с результатами других авторов (С.И. Макарова и соавт., 2002). Вероятно, здесь играют роль временной фактор экспозиции ксенобиотиков у носителей GSTM1”0/0”, а также изменение метаболизма эндогенных биологически активных веществ вследствие нарушения функции GSTM1, в том числе продуктов перекисного окисления и метаболитов арахидоновой кислоты, которые участвуют в патогенезе хронического инфекционного воспаления у лиц со смешанным генезом БА.

Для формирования РЛ важное значение имеют нарушения функции одного из ключевых генов, осуществляющих охрану целостности генома - онкосупрессора р53. Чувствительность р53 к генотоксическим повреждениям существенно зависит от функциональной активности генов детоксикации, в число которых входят глутатион-S-транферазы. Важное значение в плане подверженности р53 к повреждению генотоксическими агентами может иметь Arg/Pro полиморфизм 72 кодона 4 экзона, оказывающий модифицирующий эффект на чувствительность гена р53 к инактивации путем мутаций ( Bonafe et al, 2003, Tada et al, 2001).

У больных ХОБЛ нами выявлено повышение частоты Arg аллеля (76,7%) гена р53 при снижении частоты Pro аллеля (23,2%) и Pro/Pro генотипа (1,75%) по сравнению с популяционным контролем (65,9%, 34%, 12,7% соответственно). Различий в распределении генотипов и частоте аллелей р53 в группе ХОБЛ с больными РЛ не выявлено. Больные РЛ демонстрируют повышение частоты Arg аллеля по сравнению с популяционным контролем и тенденцию к снижению частоты Pro/Pro генотипа (П.А.Гервас, 2006). Полиморфизм гена р53 у больных ХОБЛ практически не изучен. Лишь в одной известной нам работе получены данные, свидетельствующие об ассоциации аллеля Pro с риском заболевания ХОБЛ у курящих лиц в популяции монголоидной расы (Wang et al., 2005).

Таким образом, нами обнаружено сходство распределения генотипов гена р53 (BstU1-полиморфизм 72 кодона 4 экзона) у больных РЛ и ХОБЛ: при обоих заболеваниях выявлено повышение частоты Arg аллеля и снижение частоты Pro/Pro генотипа по сравнению с популяционным контролем. Наши результаты находятся в согласии с представленными ранее В.В.Ляховичем с соавторами данными для Западно-Сибирской популяции о повышении частоты Arg аллеля в группах больных раком желудка и РЛ (1997), а также данными ряда зарубежных авторов (Papadakis et al, 2002, Wang et al, 1999). Следует отметить, что литературные сведения об ассоциации Arg/Pro полиморфизма 72 кодона 4 экзона гена р53 с РЛ достаточно противоречивы, и это не является только следствием популяционных различий. Показано, что в опухолях происходит селекция полиморфных аллелей р53 с более высокой способностью к мутациям, в частности, для опухолей легкого, молочной железы, головы и шеи и ряда других было установлено селективное преимущество опухолевых клеток, несущих р53 Arg (Furihata et al., 2002; Papadakis et al., 2002; Langerod et al., 2002; Bonafe et al., 2003).

Полученные нами данные свидетельствуют об отсутствии ассоциации полиморфизма р53 с риском заболевания БА, однако у больных БА смешанного генеза выявлена ассоциация Pro аллеля с тяжестью течения заболевания (рис. 2). Поскольку известно, что степень тяжести БА зависит от степени дефекта апоптоза лимфоцитов и эозинофилов, а Pro аллель менее эффективен в индукции апоптоза, можно полагать, что гомозиготное состояние по аллелю Pro у больных БА ассоциировано с нарушением индукции запрограммированной гибели иммунокомпетентных. Степень дефекта апоптоза при БА прямо пропорциональна активности процесса и степени тяжести заболевания (Невзорова В.А. и соавт., 2001; Мамонтова Т.В., Кайдашев И.П., 2004; Woolley et al., 1996; Kankaanranta et al., 2001).

Так, при исследовании биоптатов бронхиального эпителия показано, что уровень экспрессии гена р53 у больных БА меньше показателей здоровых лиц и наиболее низкий у больных с тяжелой степенью астмы (Vignola et al., 2001; Ivanchuk et al., 2005; Sazonov et al., 2005). Кроме того, в ряде исследований выявлен повышенный уровень хромосомных аберраций в лимфоцитах, микроядрах в эритроцитах и буккальных клетках у больных БА, что косвенно свидетельствует о нарушении систем контроля стабильности генома при этом заболевании (Буторина О.К. и соавт., 1992; Семенов А.В. и соавт, 2003).

С другой стороны, ген р53 участвует в регуляции экспрессии рецептора глюкокортикостероидов (Ganguli et al., 2002; Maiyar et al., 2006). Базисная противовоспалительная терапия тяжелой БА предполагает использование глюкокортикостероидных препаратов в высоких дозах, а тяжелое течение астмы в ряде случаев ассоциировано с устойчивостью к стероидной терапии. Возможно, вариантные генотипы р53 обладают различной функциональной активностью в отношении регуляции экспрессии рецептора глюкокортикостероидов. Полученные данные свидетельствуют о необходимости дальнейшего исследования роли функционального полиморфизма гена р53 в патогенезе тяжелой БА и в резистентности к стероидной терапии.

Хемокины продуцируются практически всеми видами клеток, в том числе и опухолевыми, которые экспрессируют хемокиновые рецепторы. Показано, что хемокины непосредственно вовлечены в процесс неоангиогенеза и принимают участие в формировании лимфогенных и органо-специфических метастазов (Strieter et al., 2004; Kakinuma et al., 2006; Zlotnik, 2006). Лигандами для CCR5 являются хемокины RANTES, MIP1- и, MCP-2 и MCP-4. CCR5-опосредованный сигнал ведет к активации иммунокомпетентных клеток и их миграции в очаг воспаления, то есть CCR5 функционально вовлечен в процессы естественного и специфического противоопухолевого иммунитета (Lavergne et al., 2004). Имеются свидетельства о роли CCR5 в метастазировании опухолей (Deventer et al., 2005). Важными представляются и уже упоминавшиеся выше данные о вовлечении CCR5 в регуляцию транскрипционной активности р53 модифицированных клеток и связи CCR5del32 полиморфизма с прогрессией рака молочной железы (Manes et al., 2003), а также о накоплении CCR5/CCR5del32 генотипов у больных РЛ с метастазами в регионарные лимфоузлы (Севостьянова Н.В и соавт., 2004). Все вышесказанное послужило весомым основанием для исследования полиморфизма гена хемокинового рецептора CCR5 у больных ХОБЛ и БА (рис. 3).

У больных ХОБЛ не выявлено изменений в распределении генотипов гена CCR5 по сравнению с популяционным контролем и больными РЛ. Однако отмечена более низкая, чем в контроле, частота сочетаний генотипов CCR5/CCR5-Pro/Pro, при этом значимых различий с группой РЛ не выявлено (рис.4). С одной стороны, это указывает на протективное значение данного сочетания генотипов в отношении формирования ХОБЛ и подтверждает данные, представленные выше, в отношении Pro/Pro генотипа и Pro аллеля. С другой стороны, это дает основания заключить об отсутствии различий в распределении генотипов гена CCR5 (полиморфизм CCR5del32) у больных ХОБЛ и РЛ.

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»