WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

Оценить в сравнительном аспекте частоту распределения генотипов патогенетически значимых для рака легкого генов (ферментов биотрансформации ксенобиотиков 2 фазы, апоптоза и рецептора хемокинов) и особенности местного иммунитета бронхиального эпителия у больных хронической обструктивной болезнью легких, бронхиальной астмой и раком легкого.

Задачи исследования:

  1. Провести сравнительную оценку распределения функциональных и «нулевых» генотипов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков второй фазы GSTT1 и GSTM1 у больных раком легкого, ХОБЛ и бронхиальной астмой.
  2. Сравнить распределение генотипов и частот аллелей (BstU1- полиморфизм 72 кодона 4 экзона) гена р53 у больных раком легкого, ХОБЛ и бронхиальной астмой.
  3. Исследовать распределение генотипов и аллелей гена хемокинового рецептора CCR5 (CCR5del32 полиморфизм) у больных бронхиальной астмой и ХОБЛ в сравнении с контрольной группой и больными раком легкого.
  4. Оценить особенности воспаления и цитокинового профиля в слизистой бронхиального дерева у больных раком легкого, ХОБЛ и больных бронхиальной астмой.
  5. Исследовать иммунологические показатели на системном и местном уровне у больных раком легкого, ХОБЛ и бронхиальной астмой в зависимости от полиморфизма изучаемых генов.

Научная новизна

Получены новые данные о повышенной частоте «нулевого» генотипа гена GSTM1, сравнимой с таковой у больных РЛ, у курящих больных ХОБЛ по сравнению с популяционным контролем для лиц европеоидного происхождения Западно-Сибирского региона.

Показано, что частота «нулевых» генотипов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков второй фазы GSTT1 и GSTM1 и их сочетаний у больных БА смешанного генеза существенно превышает уровень популяционного контроля и сравнима с таковой у больных РЛ. У больных с астмой атопического генеза не отмечено повышения частоты генотипа GSTM1”0/0” по сравнению с контролем.

Получены новые данные о повышенной частоте Arg аллеля гена р53 (BstU1- полиморфизм 72 кодона 4 экзона) у больных ХОБЛ, которая не отличалась от таковой у больных РЛ. Напротив, частота генотипа Pro/Pro у больных ХОБЛ, как и у больных РЛ, была более низкой по сравнению с популяционным контролем. Одинаковое распределение генотипов гена р53 у больных ХОБЛ и РЛ можно рассматривать с одной стороны, как свидетельство сходства механизмов вовлечения р53 в патогенез ХОБЛ и РЛ, а с другой – как указание на повышенный риск формирования РЛ у больных ХОБЛ.

Выявлена связь Pro аллеля гена р53 с повышенным уровнем лимфоцитов в индуцированной мокроте у больных ХОБЛ и БА.

Получены приоритетные данные о более низкой частоте встречаемости делеционного аллеля гена хемокинового рецептора ССR5 у больных БА по сравнению с популяционным контролем в Западно-Сибирском регионе.

Впервые в пределах одной популяции проведен сравнительный анализ полиморфизма патогенетически значимых для формирования РЛ генов у больных БА различного генеза, результаты которого свидетельствуют о различной степени предрасположенности к формированию РЛ у больных астмой с атопическим и смешанным генезом заболевания.

У 50% обследованных больных РЛ выявлены признаки вторичной иммунной недостаточности, которые предшествовали развитию злокачественного процесса, сходные со структурой инфекционного синдрома вторичного иммунодефицита у больных ХОБЛ и БА.

Теоретическая и практическая значимость

В работе выявлены существенные различия в распределении генотипов и частоте встречаемости вариантных аллелей между группами больных с атопической астмой и больных старше 40 лет, в которой превалируют больные с астмой смешанного генеза. Во-первых, это свидетельствует о различной роли изучаемых генов в патогенезе разных форм БА, во-вторых, указывает на неоднородность группы БА в плане возможной предрасположенности к РЛ. Это позволяет объяснить хотя бы частично неоднозначность результатов проводившихся ранее клинико-эпидемиологических исследований о взаимосвязи БА и РЛ.

В результате анализа полиморфизма гена онкосупрессорного белка р53 у больных БА получены данные об ассоциации Pro аллеля и Pro/Pro генотипа гена р53, а также сочетания генотипов ССR5/CCR5-Pro/Pro с тяжелым течением БА смешанного генеза, что свидетельствует о целесообразности исследования роли полиморфизма гена р53 в формировании резистентности к кортикостероидной терапии.

Сведения о наличии «нулевых» генотипов ФБК 2 фазы и Arg аллеля гена р53 (BstU1-полиморфизм) у больных ХОБЛ могут быть использованы в качестве дополнительных критериев при формировании групп повышенного риска по РЛ.

Полученные данные об ассоциации CCR5del32 с низким риском формирования БА атопического генеза указывают на актуальность дальнейшего исследования связи полиморфизма CCR5 с предрасположенностью к БА у лиц с отягощенным семейным анамнезом.

Апробация диссертации

Основные положения и результаты научных исследований были доложены на бъединенном иммунологическом форуме с международным участием, г. Екатеринбург (2004); IX Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», г. Санкт-Петербург (2005); Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 15-летнему юбилею Красноярского Краевого Центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями, «Дни иммунологии в Сибири», г. Красноярск (2005); научно-практической конференции НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН «Иммунология на рубеже веков: к 75-летию со дня рождения академика РАМН Н.В. Васильева», г. Томск (2005); 15 ежегодном конгрессе Европейского респираторного общества, г. Копенгаген (2005); III ежегодном национальном конгрессе молодых исследователей в области сердечно-сосудистых и респираторных заболеваний, г. Виннипег (2006); VII конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке», г. Томск (2006); VI съезде аллергологов и иммунологов СНГ, Российском национальном конгрессе аллергологов и иммунологов, III Российской конференции по иммунотерапии, г. Москва (2006); 16 ежегодном конгрессе Европейского респираторного общества, г. Мюнхин (2006).

Публикации

Результаты исследования опубликованы в 15 печатных работах, отражающих основные положения диссертации.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 148 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав, включающих обзор литературы, материалы и методы исследования, главы с изложением собственных результатов, заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Библиографический указатель включает 205 источников, из них 38 отечественных, 167 зарубежных. Работа иллюстрирована 29 таблицами и 16 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика групп больных

В исследование были включены 420 больных с патологией легких, из них 180 больных РЛ, 158 больных БА и 83 больных ХОБЛ (табл. 1). Работа проводилась с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (указ Президента РФ от 24.12.1993 № 2288).

Таблица 1.

Характеристика групп обследованных

Группы

Показатели

РЛ

БА

ХОБЛ

Контроль для РЛ и ХОБЛ

Контроль для БА

Число обследованных

180

158

83

188

269

Пол,

м/ж

165/15

56/102

70/13

188/0

91/178

Возраст, M±m

59,1±0,9

49,8±1,3

58,3±1,1

55,8±5,3

52,0±3,3

РЛ – группа больных раком легкого

БА – группа больных бронхиальной астмой

Больные РЛ находились на стационарном лечении в торако-абдоминальном отделении ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (зав. отделением – д.м.н. С.А. Тузиков). Подавляющее число больных РЛ было мужского пола: обследовано 165 мужчин (92%) и 15 женщин (8%), возрастной интервал составил от 32 до 78 лет (средний возраст манифестации заболевания 59,1±0,9 лет). Анамнез курения был известен у 86 обследованных, среди них доля курящих составила 87,2%. Клинический диагноз РЛ устанавливался на основании клинического, морфологического, эндоскопического и рентгенологического обследования. Стадия онкологического процесса определялась в соответствии с четвертым пересмотром Международной классификации опухолей по системе TNM (Женева, 1987), а также вторым пересмотром (UICC, 1992) и дополнением к классификации TNM (UICC, 1993), одобренным Американским комитетом по раку (AJCC). Образцы опухолей легкого и прилежащих к опухоли тканей легкого были получены в результате диагностических биопсий и/или после оперативных вмешательств по поводу РЛ, гистологическое исследование проводилось в отделении патологической морфологии ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (руководитель отделения – д.м.н., профессор В.М. Перельмутер).

Больные БА находились на стационарном лечении в аллергологическом отделении Межвузовской больницы (при кафедре иммунологии и аллергологии СибГМУ, зав. кафедрой д.м.н., профессор Климов В.В.) и в пульмонологическом отделении Городской больницы № 3 (при кафедре терапии педиатрического факультета СибГМУ, зав. кафедрой – д.м.н., профессор Волкова Л.И.). Диагноз устанавливался в соответствии с Глобальной стратегией лечения и профилактики БА (GINA, 2003) на основании жалоб на приступы затрудненного дыхания или приступообразный кашель, купирующиеся ингаляцией 2-агонистов, наличия обратимой бронхиальной обструкции, подтвержденной объективными методами обследования (суточный разброс ПСВ > 20%, прирост ОФВ1 > 15%), положительных результатов кожного тестирования с наиболее часто встречаемыми аллергенами для Западно-Сибирского региона (домашняя пыль, библиотечная пыль, шерсть кошки, береза, полынь, одуванчик, лебеда, овсяница, ольха, костра, одуванчик, производитель – ОАО «Биомед», г. Москва).

Больные ХОБЛ находились на стационарном лечении в пульмонологическом отделении Городской больницы № 3 (при кафедре терапии педиатрического факультета СибГМУ, зав. кафедрой – д.м.н., профессор Волкова Л.И.) и в торако-абдоминальном отделении ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (зав. отделением – д.м.н. С.А. Тузиков). Всего обследовано 83 человека, из них 70 мужчин (84,3%) и 13 женщин (15,6%), в возрасте от 33 до 87 лет, средний возраст составил 58,3±1,1 лет. Доля курящих составила 80,7%. Диагноз устанавливался по рекомендациям, представленным программой «GOLD» (2003) на основании жалоб на хронический кашель с мокротой и одышку, наличия факторов риска в анамнезе и результатов исследования функции внешнего дыхания (ОФВ1/ФЖЕЛ<70% и постбронходилатационное значение ОФВ1<80% от должного). Подавляющее большинство составили больные с тяжелой и крайне тяжелой стадией заболевания: стадия I диагностирована у 12 пациентов (14,4%), стадия II диагностирована у 20 пациентов (24,0%), стадия III у 27 (32,5%), стадия IV – у 24 (28,9%).

При оценке полиморфизма генов GSTT1 и GSTM1 у больных РЛ, БА и ХОБЛ в качестве популяционного контроля использовали выборки здоровых лиц европеоидного происхождения, проживающих в г. Томске и г. Новосибирске, которые не отличались по распределению генотипов (Ляхович В.В., 1997; Севостьянова Н.В., 2003). Контрольные выборки были сформированы из здоровых мужчин и женщин отдельно для больных ХОБЛ и РЛ, и для больных БА, с учетом соответствия возрастного и полового состава, данные любезно предоставлены В.А. Белявской (Новосибирск).

Методы исследования

Материалом для исследования служили периферическая кровь и индуцированная мокрота (ИМ).

Для выявления делеции гена хемокинового рецептора (CCR5del32-полиморфизм) использовали аллель-специфичную полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Амплифицировали фрагмент гена размером 276 п.н., несущий потенциальную делецию в 32 п.н., с использованием фланкирующих праймеров (Юдин Н.С. и соавт., 1998). Применяли праймеры CCR5F: 5’ – GAA-GGT-CTT-CAT-TAC-ACC-TG и CCR5R: 5’ – AGA-ATT-CCT-GGA-AGG-TGT-TC из генетического банка, каталожный номер U54994. Наличие продукта амплификации размером только 276 п.н. интерпретировалось как гомозиготное состояние по нормальному аллелю (генотип CCR5/CCR5), наличие продукта размером только 244 п.н. – как гомозиготное состояние по делеционному аллелю CCR5del32 (генотип CCR5del32/CCR5del32), наличие фрагментов 276 и 244 п.н. – как гетерозиготное (генотип CCR5/CCR5del32).

Генотипирование гена р53 осуществляли методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ) с помощью праймеров: Pr1: 5’ – TTG CCG TCC CAA GCA ATG GAT GA – 3’ и Pr2: 5’ – TCT GGG AAG GGA CAG AAG ATG AC – 3’. Для рестрикции фрагмента гена р53 использовали эндонуклеазу BstFN1. Визуализацию рестрикционных фрагментов гена р53 (199, 113 и 86 п.н.) проводили с помощью электрофореза в 7% полиакриламидном геле.

Типирование образцов по генам GSTT1 и GSTM1 проводили путем мультиплексной ПЦР (Spurdle et al., 2001). Использовали три пары олигонуклеотидных праймеров, специфичных к участку гена рецептора эстрогенов, ER (F: 5’ – CAA-GTC-TCC-CCT-CAC-TCC-CC; R: 5’ –GTG-CGA-GTG-GCT-CAG-TGT-GT) и генов GSTT1 (F: 5’ –GGT-CAT-TCT-GAA-GGC-CAA-GG; R: 5’ –TTT-GTG-GAC-TGC-TGA-GGA-CG), и GSTM1 (F: 5’ –TGC-TTC-ACG-TGT-TAT-GGA-GGT-TC; R: 5’-GTT-GGG-CTC-AAA-TAT-ACG-GTG-G). Гомозиготность по нулевым аллелям (0/0) генов GSTT1 и GSTM1 определяли по отсутствию на электрофореграммах продуктов амплификации фрагментов размером 131 п.н. и 114 п.н., соответственно. Наличие этих фрагментов свидетельствовало о присутствии, по крайней мере, одной нормальной (без делеции) копии генов (гомо- и гетерозиготы, генотипы +/+ и +/0). Участок гена ER размером 183 п.н. использовали в качестве внутреннего контроля амплификации.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»