WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Результаты показывают, что наряду с первоначальным стимулированием поглощения кислорода (рис. 9) наблюдается значительное снижение синтеза АТФ. Наиболее полно этот эффект выражается в изменении коэффициента фосфорилирования Р/О (табл. 1). Значение Р/О заметно снижается в 10,5-38 раза в случае использования дельта-эндотоксина в концентрации 100 мкг/мл и в 2-9,5 раза – 50 мкг/мл. С учетом того, что дыхание в первые 10 мин остается даже более интенсивным, чем в норме, следует констатировать, что произошло разобщение процессов окислительного фосфорилирования и дыхания. Причем наиболее вероятно его действие как переносчика протонов.

Таблица 1

Влияние дельта-эндотоксина на интенсивность дыхания и синтез АТФ клетками HeLa

Концентрация токсина, мкг/мл

Эффект

1 мин

5 мин

10 мин

15 мин

30 мин

60 мин

Норма (в отсутствие токсина)

100

потребление О2

2,28 ± 0,26

***

1,88 ± 0,25

1,60 ± 0,08

1,20 ± 0,16

***

0,40 ± 0,09

***

0,06 ± 0,02

***

1,70 ± 0,27

синтез АТР

0,53 ± 0,07

***

0,43 ± 0,06

***

0,40 ± 0,08

***

0,13 ± 0,03

***

0,05 ± 0,02

***

0

2,86 ± 0,08

Р/О

0,23 ± 0,03

***

0,23 ± 0,03

***

0,25 ± 0,03

***

0,11 ± 0,01

***

0,13 ± 0,02

***

0

1,68

50

потребление О2

1,69 ± 0,08

1,88 ± 0,19

1,80 ± 0,21

1,40 ± 0,15

1,10 ± 0,26

0,82 ± 0,12

**

1,70 ± 0,27

синтез АТР

1,67 ± 0,17

***

1,29 ± 0,06

***

0,77 ± 0,08

***

0,25 ± 0,09

***

0,22 ± 0,03

***

0,08 ± 0,03

***

2,86 ± 0,08

Р/О

0,99± 0,06

***

0,66± 0,04

***

0,43± 0,03

***

0,18± 0,01

***

0,20± 0,01

***

0,10± 0,01

***

1,68

Примечание: * – р 0,05; ** – р 0,01; *** – р 0,001 при n = 20 (n – число пар измерений)

Эффект начального стимулирования дыхания является компенсаторной реакцией, связанной с разобщением. Очевидно, этот процесс заканчивается уже в первые 10 мин воздействия токсина, что в дальнейшем вызывает деэнергизацию митохондрий, а, следовательно, и клетки, и всю последующую цепь событий, важнейшим из которых является нарушение транспорта ионов и неэлектролитов в клетке.

2.5 Влияние дельта-эндотоксина на процесс гликолиза

В условиях повышенного потребления кислорода увеличивается и потребность митохондрии в восстановительных эквивалентах, поставляемых субстратами дыхательной цепи. Это должно привести к ускорению гликолиза в цитозоле. Однако, поскольку процессы дыхания и окислительного фосфорилирования в митохондрии разобщены, прекращается синтез АТФ, происходит деэнергизация митохондрии, что приводит к торможению работы дыхательной цепи и снижению потребности в субстратах – продуктах гликолиза. В результате прекращается приток в митохондрии метаболитов глюкозы. Вероятно, вследствие дальнейшего снижения дыхательной активности гликолиз переключается на анаэробный режим, приводя к повышению активности лактат дегидрогеназы и концентрации лактата в цитозоле.

Для проверки этих предположений нами было предпринято экспериментальное исследование, включающее анализ активности ключевых ферментов гликолиза клеток HeLa: 3-фосфоглицерат дегидрогеназы (3-ФГДГ) и лактат дегидрогеназы (ЛДГ). В течение первых 10 мин действия эндотоксина активность 3-ФГДГ превышает ее уровень в интактных клетках (норма). При этом в случае концентрации токсина 100 мкг/мл активирование на 25% начиналось уже через 1 мин и достигало максимума (60%) через 5 мин. Через 10 мин активность фермента оставалась высокой и составляла 46% от нормы. Затем начиналось снижение активности, которая достигла через 15 мин 80% исходной. Снижение активности продолжалось до конца опыта, и через 60 мин ее значение составило 15% от нормы.

В случае концентрации 50 мкг/мл активирование было менее значительным и максимум (32%) отмечали через 10 мин. Также более медленно происходило и снижение активности, достигая через 60 мин 32% исходной.

Эти данные согласуются с представленными на рисунке 8, демонстрирующими динамику изменения потребления кислорода клетками под действием тех же концентраций дельта-эндотоксина. Сопоставление этих результатов показывает, что начальное стимулирование дыхания приводит к ускорению катаболизма глюкозы с образованием пирувата и 3 – фосфоглицерата, и как следствие, субстратов дыхательной цепи. Однако в периоды времени более 10 мин для концентрации 100 мкг/мл и 15 мин для 50 мкг/мл происходит снижение интенсивности дыхания, и вслед за этим угнетается гликолиз. Фактически происходит затухание процесса в течение 60 мин. Это связано не только с практически полным прекращением синтеза АТФ в митохондриях, но и с тем, что к этому времени происходит достаточно интенсивное разрушение клеток с освобождением их содержимого в культуральную среду. Как видно из данных, представленных на рисунке 8 и 9, через 15 мин действия дельта-эндотоксина начинается нарастающее снижение интенсивности дыхания и синтеза АТФ. Однако к этому времени остается еще много не разрушенных клеток. Возможно, что в таких анаэробных условиях клетки переключаются на преимущественное образование в ходе гликолиза лактата.

Рис. 10. Изменение активности 3-фосфоглицерат дегидрогеназы в цитозоле клеток под действием дельта-эндотоксина в концентрации 100 мкг/мл и 50 мкг/мл

Было отмечено активирование ЛДГ в клетках HeLa (рис. 11) в период времени от 15 до 30 мин, то есть в условиях наблюдаемого уменьшения потребления кислорода. Через 5-15 мин, напротив, отмечено практическое отсутствие активности ЛДГ. Это объясняется подавлением образования лактата в условиях повышенной аэробности.

Рис. 11. Изменение активности лактат дегидрогеназы в клетках HeLa в результате действия дельта-эндотоксина

В период времени после 15 мин, когда резко снижается поглощение кислорода, гликолиз переключается на анаэробный режим с образованием лактата, о чем свидетельствует увеличение активности ЛДГ.

Рис. 12. Изменение активности лактат дегидрогеназы в супернатанте в результате действия на клетки HeLa дельта-эндотоксина

Нами регистрировалась активность ЛДГ во внеклеточной (культуральной) среде через разные промежутки времени действия токсина. Выход ЛДГ в культуральную среду под действием дельта-эндотоксином (рис. 12) регистрировался уже спустя 5 мин после начала инкубации. При этом активность фермента была выше при концентрации токсина 100 мкг/мл (21% общей активности) по сравнению с 50 мкг/мл (8%). Далее активность ЛДГ возрастала практически линейно при обеих концентрациях и достигала 100% (100 мкг/мл) и 79% (50 мкг/мл) через 60 мин инкубации.

Таким образом, усиление клеточного дыхания приводит к ускорению процесса гликолиза в клетках культуры в течение всего периода усиленного дыхания (1-15 мин). Это связано с возросшими потребностями митохондрий в субстратах цепи переноса электронов (дыхательной цепи). Синтез АТФ в то же время значительно снижается в результате разобщения, что приводит к деэнергизации митохондрии и нарушению транспорта веществ через ее мембрану. В результате происходит снижение интенсивности дыхания, по-видимому, в результате резкого снижения поступления в митохондрии субстратов для цитратного цикла и прекращения вследствие этого наработки восстановительных эквивалентов. Далее, как следует из представленных выше данных, происходит переключение гликолиза преимущественно на анаэробный механизм с образованием лактата и активированием ЛДГ (через 10 мин инкубации). Однако в этот же период появляются нарушения в проницаемости цитоплазматической мембраны, которые проявляются в наибольшей степени после 15 мин инкубации. Результатом этого является нарастающий во времени и зависящий от концентрации токсина выход ЛДГ во внеклеточную среду.

Следует отметить, что, по-видимому, определение уровня ЛДГ в культуральной жидкости может служить удовлетворительным и простым тестом для установления чувствительности клеток к дельта-эндотоксину.

Разобщающая способность дельта-эндотоксина подтверждена методами ИК - и ЯМР-спектроскопии. Показано, что он обладает лабильными протонами, которые способен легко отдавать после растворения. Большое количество «кислых» протонов обусловлено доминирующим содержанием в составе белкового дельта-эндотоксина аспарагиновой и глутаминовой аминокислот. Вещества природного или синтетического происхождения, обладающие лабильными протонами, могут являться разобщителями процессов окислительного фосфорилирования (синтеза АТР), происходящего в митохондриях, если они обладают способностью проникать через биологические мембраны. Возможность этого подтверждает действие дельта-эндотоксина, полученного методом щелочного гидролиза, на искусственную азолектиновую мембрану, который в концентрации 50 и 100 мкг/мл вызывал падение ее сопротивления в 2-5 раз.

ВЫВОДЫ

1. Цитопатическое действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis subsp. sotto пропорционально его концентрации и времени контакта с клетками; связано с изменением структуры клеток, проявляющимся как нарастающая вакуолизация с последующим разрушением клеток, и различается по силе эффекта для разных клеточных линий: чувствительность клеток HeLa значительно выше, чем клеток B16 и L1210.

2. При действии дельта-эндотоксина после 15 мин выявлено нарушение транспорта ионов K+, Na+, Ca2+ и Mg2+ через цитоплазматическую мембрану клеток HeLa, B16 и L1210 вслед за ранней активацией Mg2+-зависимой K+, Na+- АТФазы. Обнаружена общая для всех типов клеток закономерность уменьшения внутриклеточной концентрации K+, и Mg2+ при возрастающей концентрации Na+ и Ca2+.

3. Установлено, что дельта-эндотоксин в первые минуты действия угнетает синтез АТФ на фоне активации дыхания, действуя на культуры клеток аналогично разобщителям процессов окислительного фосфорилирования и дыхания.

4. Дельта-эндотоксин на первых этапах действия (до 15 мин) вызывает интенсификацию процесса гликолиза в клетках HeLa, повышая активность 3-фосфоглицерат дегидрогеназы; затем ее уровень постепенно снижается, уступая место активации лактат дегидрогеназы – фермента, характерного для анаэробного режима гликолиза.

5. Финальные этапы действия дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis subsp. sotto, предшествующие разрушению клеток, связаны с деэнергизацией митохондрий, снижением потребления кислорода, активацией анаэробного пути гликолиза, нарушением целостности мембран и выходом лактат дегидрогеназы во внеклеточную среду.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»