WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Как показали результаты, растворы дельта-эндотоксинов B. thuringiensis subsp. galleriae, alesti, kurstaki, thuringiensis, sotto, dendrolimus в концентрации 5 мкг/мл оказывают воздействие на клетки HeLa, L1210, B16 и SCLd-135. При этом существенных различий в способности токсинов различного происхождения разрушать клетки не было отмечено. В результате для дальнейших исследований была выбрана культура, обладающая максимальной продукцией дельта-эндотоксина. Количественный анализ способности штаммов продуцировать дельта-эндотоксин показал, что в наибольшей степени она выражена у штаммов sotto 617 (129,7 мг/г сухой массы культуры).

Рис. 1. Цитопатическое действие различных концентраций дельта-эндотоксинов B. thuringiensis subsp. sotto

Сравнение цитопатической активности дельта-эндотоксина на изучаемые культуры показало, что наблюдается выраженная зависимость ее от концентрации токсина (рис. 1). Концентрация 20 мкг/мл не оказывала действия на клетки меланомы мышей – В 16 и лимфоидной лейкемии кроликов – L 1210 и приводила к разрушению 17 – 20% клеток рака шейки матки человека – НеLa и клетки кишечного эпителия непарного шелкопряда - SCLd-135.

Концентрация 100 мкг/мл вызывала разрушение несколько более половины клеток В16 и L1210 (57 и 69%, соответственно) и большей части клеток НеLa и SCLd-135 (90 – 95%, соответственно) Полное разрушение клеток первых двух культур наблюдали только в случае действия 200 мкг/мл токсина.

Полученные данные показывают не только выраженную зависимость цитопатического эффекта от концентрации дельта-эндотоксина, но и существенные различия в чувствительности изучаемых культур к нему.

На рисунках 2 и 3 представлены результаты изучения влияния продолжительности времени инкубации на цитопатическое действие дельта-эндотоксина в двух концентрациях: 50 и 100 мкг/мл. При действии эндотоксина в концентрации 50 мкг/мл (рис. 2) разрушение клеток L1210 начиналось через 10 мин (3,2%) и через 120 мин достигало максимальной величины в 64,6%. В случае В16 разрушение 12,5% отмечено через 15 мин. Для НеLa и SCLd-135 отмечен значительный цитопатический эффект уже после 5 мин инкубации с токсином (17,0 и 18,1%, соответственно). Через 120 мин оказались разрушенными 86,6 и 84,0% клеток, соответственно.

Рис. 2. Влияние времени инкубации на цитопатическое действие дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. sotto (концентрация 50 мкг/мл)

Действие дельта-эндотоксина в концентрации 100 мкг/мл приводило к более значительному цитолитическому действию (рис. 3). Уже в первые 5 мин во всех изученных образцах отмечено наличие разрушенных клеток, достигавшее 8,6% для L 1210; 5,0 для В 16;27, 5 для SCLd-135 и 27,1 для НеLa. Через 30 мин количество лизированных клеток составило 57,0; 69,1; 90,9 и 94,9%, соответственно. Через 60 мин клетки SCLd-135 и НеLa оказались полностью разрушены, и случае В16 аналогичный эффект наблюдали только через 120 мин. Для клеток L 1210 через 120 мин инкубации отмечено 91,2% разрушенных клеток.

Рис. 3. Влияние времени инкубации на цитопатическое действие дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. sotto (концентрация, 100 мкг/мл)

Таким образом, полученные результаты указывают на способность дельта-эндотоксинов B. thuringiensis subsp. sotto, штамм 617 оказывать цитолитическое действие на клетки исследованных культур. При этом отмечена выраженная прямо пропорциональная зависимость оказываемого эффекта от концентрации дельта-эндотоксина. Цитотоксическое действие было тем более значительным, чем продолжительнее была инкубация. Следует отметить, что изученные культуры различаются по степени чувствительности к данному токсину: для SCLd-135 и НеLa ее можно характеризовать как высокую, тогда как для L 1210; и В16 – среднюю. Для сравнения была использована культура клеток кишечного эпителия непарного шелкопряда – SCLd-135, высокая чувствительность которой к токсину subsp. galleriae была отмечена ранее (Каменек, 1989).

2.2. Микроскопическое изучение действия дельта-эндотоксина на клеточные культуры

В ходе исследования, проведенного на клетках культуры НеLa, было установлено, что первые изменения клеток по сравнению с нормой наблюдались уже через одну минуту после начала инкубации с раствором дельта-эндотоксина (рис. 4.2). Клетки начинали вакуолизироваться через этот промежуток времени, при чем степень вакуолизации возрастала с увеличением продолжительности инкубации и была пропорциональна концентрации дельта-эндотоксина. Так, если при использовании концентрации 100 мкг/мл через 1 мин было вакуолизировано до 90% всех клеток и появились первые разрушенные, то при 50 мкг/мл до 50%.

Рис. 4. Действие дельта-эндотоксина на культуру клеток HeLa: 1 – нормальные клетки (контроль), 2 – вакуолизация через 1 мин инкубации (100 мкг/мл), 3 – вакуолизация и признаки разрушения клеток через 15 мин, 4 – разрушение клеток (через 30 мин инкубации при концентрации 100мкг/мл или через 2 ч – 50 мкг/мл), световая микроскопия, увеличение в 400 раз.

Через 15 мин во всех сериях опытов вакуолизация достигала 100 %, и размеры клеток значительно увеличились (рис. 4.3). В это же время нарастают признаки разрушения клеток. Через 30 мин инкубации с токсином в концентрации 100 мкг/мл не обнаруживается ни одной целой клетки (рис. 4.4).

На представленных микрографиях видно, что кроме появления большого числа вакуолей, наблюдаются и такие признаки нарушения структуры клеток, как истончение клеточной мембраны и зернистость ядер.

В контроле, где клетки инкубировались в том же растворе, что и в опытах, только в отсутствие дельта-эндотоксина, каких-либо изменений в структуре клеток обнаружено не было (рис. 4.1).

Столь значительная вакуолизация клеток вероятнее всего является следствием нарушения активного транспорта ионов и, прежде всего, натрия, концентрация которого в норме во внутриклеточной среде должна быть ниже, чем во внеклеточной.

2.3. Действие дельта-эндотоксина на содержание ионов в клетках

Для получения более полной картины действия дельта-эндотоксина было проведено изучение концентраций ионов в различные моменты времени. Данные, представленные на рисунках 4 и 5, показывают, что, начиная с 15 минут после добавления токсина, значительно изменялась концентрация всех определяемых ионов в клетках HeLa. Наибольшие отклонения от нормы наблюдали в концентрации ионов Na+, причем степень повышения уровня зависела от количества токсина.

Рис. 4. Влияние дельта-эндотоксина (50 мкг/мл) на концентрацию ионов в клетках HeLa

Максимальное увеличение составляло 203% через 30 мин для 100 мкг/мл токсина и 182% через 1 ч для 50 мкг/мл. Существенно снижалась концентрация ионов K+, достигая 61% от исходного значения через 30 мин для 100 мкг/мл и 60% через 1 ч для 50 мкг/мл.

Для Mg2+ отмечено снижение до 78% через 30 мин для 100 мкг/мл и 71% через 1 ч для 50 мкг/мл, соответственно. Концентрация ионов Ca2+, наоборот, повышалась через тот же период времени до 130 и 136%, соответственно.

Изменение концентраций ионов, хотя и менее значительное, отмечено и в случае менее чувствительных к дельта-эндотоксину культур и Максимальное увеличение концентрации ионов Na+ при использовании 100 мкг/мл токсина составляло через 1 час 179% для L1210 и 167% для В16. Существенно снижалась концентрация ионов K+, достигая 76 и 72%, соответственно, от исходного значения через 30 мин. Для Mg2+ отмечено снижение до 78 и 83% через 30 мин. Концентрация ионов Ca2+, наоборот, повышалась через тот же период времени до 130% в обоих случаях.

Поддержание постоянства концентраций ионов Ca2+ и Mg2+ чрезвычайно важно из-за высокой их биологической активности. Ca2+ в основном находится в органеллах – митохондриях, эндоплазматическом ретикулуме, кальцисомах, а не в цитозоле.

Рис. 5. Влияние дельта-эндотоксина (100 мкг/мл) на концентрацию ионов в клетках культуры HeLa

Полученные результаты согласуются с ранее приведенными по вакуолизации клеток. В период (от 15 мин и далее) происходит нарастание вакуолизации, связанной с нарушением транспорта ионов через цитоплазматическую мембрану, и в первую очередь это относится к ионам Na+, транспорт которого неразрывно связан с транспортом воды.

Результаты, представленные на рисунке 6, показывают значительное активирование K+, Na+-АТРазы культур клеток L1210 и HeLa. Активирование начиналось уже через 1 мин после добавления токсина и составляло 47 и 59%, соответственно. Максимальных значений активность фермента достигала через 15 мин и составляла 638 и 213%, соответственно.

Рис. 6. Влияние дельта-эндотоксина B. thuringiensis (50 мкг/мл) на Mg2+-зависимую K+, Na+-АТФазу культур клеток

Изменение активности данного фермента наблюдается как при нарушении целостности мембраны, так и при действии веществ, разобщающих процессы дыхания и окислительного фосфорилирования.

Поскольку активность фермента характеризует его способность гидролизовать субстрат (АТФ), и известно, что эта способность резко повышается как в условиях разобщения окислительного фосфорилирования и дыхания, так и при нарушении целостности мембраны, активирование данной ферментной системы фактически отражает степень деэнергизации клетки. Торможение транспортной функции приводит к накоплению промежуточных продуктов реакции: АДФ и Фн, что и регистрируется в наших экспериментах, как усиление гидролитической активности АТФазы.

Было показано, что способность гидролизовать АТФ не является свойством самого эндотоксина катализировать гидролиз АТФ с высвобождением фосфата. Он также не может являться поставщиком свободного (неорганического) фосфата в реакционную среду.

2.4. Действие дельта-эндотоксина на дыхательную активность и синтез АТФ в клетках

Нами было выполнено изучение влияния дельта-эндотоксина на дыхание и окислительное фосфорилирование в клетках наиболее чувствительной культуры HeLa.

Полученные данные (рис. 7) демонстрируют стимулирование поглощения кислорода клетками HeLa на 74% через 1 мин инкубации с токсином в концентрации 150 мкг/мл. Далее следовало быстрое снижение дыхательной активности до величины ниже контрольной (67%).

При концентрации токсина 100 мкг/мл начальное стимулирование дыхания на 51% далее снижалось, достигая к 5 мин 38%. Очевидно, что при концентрациях, превышающих 150 мкг/мл, поглощение О2 усиливается в более ранние периоды, что мы не можем зарегистрировать, используя имеющиеся в распоряжении методики.

Рис. 7. Действие дельта-эндотоксина на потребление кислорода клетками

При небольшой концентрации токсина 50 мкг/мл нами зарегистрирован незначительно нарастающий во времени эффект 4 и 15 % через 1 и 5 мин, соответственно. В случае 20 мкг/мл вообще не удалось зарегистрировать эффекта.

Полученные данные указывают на зависимость действия дельта-эндотоксина от его концентрации и времени воздействия на респираторную активность клеток. При этом, чем больше концентрация токсина, тем раньше наблюдается начальное стимулирование и последующее угнетение потребления клетками кислорода.

Был проведен анализ временной последовательности описанных выше явлений, с целью дальнейшей конкретизации механизма. Для этого были выбраны две концентрации эндотоксина (100 и 50 мкг/мл), которые вызывают умеренный разобщающий эффект, а, следовательно, позволяют охватить более значительный промежуток времени при наблюдении эффекта. Параллельно измеряли уровень продукции АТФ и рассчитывали коэффициент фосфорилирования (Р/О). Известно, что в дышащих митохондриях скорость переноса электронов в дыхательной цепи, а следовательно, и скорость синтеза АТФ, определяется в первую очередь относительными концентрациями АДФ, АТФ и Фн (неорганического фосфата) в окружающей среде, а не концентрациями субстратов дыхания, например, пирувата. тем выше, чем выше концентрация АДФ и Фн и ниже – АТФ. Это явление носит название дыхательного (акцепторного) контроля. Математически это выражается отношением Р/О, где Р представляет концентрацию АДФ. В условиях эксперимента на интактных митохондриях при постоянстве начальных концентраций АДФ и Фн в окружающей среде убыль концентрации АДФ пропорциональна приросту Фн, что и будет являться мерой скорости синтеза АТФ в митохондрии.

Эффект начального стимулирования поглощения кислорода в течение первых 10 мин воздействия дельта-эндотоксина утрачивается к 15 мин его воздействия (рис. 8). При этом как стимулирование, так и угнетение потребления кислорода митохондриями пропорциональны концентрации токсина.

Рис. 8. Изменение потребления кислорода клетками под действием дельта-эндотоксина

Начальное стимулирование под действием концентрации 100 мкг/мл составляет через 1 мин около 51 % от исходной, тогда как 50 мкг/мл стимулирования не вызывала. Скорость же снижения поглощения кислорода более значительна в случае концентрации 100 мкг/мл по сравнению с 50. Так, уже через 10 мин воздействия она практически возвращается к норме, тогда как для 50 мкг/мл остается на 6 % выше нормы. В конечный момент эксперимента (60 мин) эти значения составляют 4 и 48 % от контроля, соответственно. Уровень поглощения О2 митохондриями в норме, при этом составлял 15-16 мкМ/106 клеток в 1 мин.

Уже в первую минуту воздействия эндотоксина происходит резкое снижение потребления АДФ и Фн, а, следовательно, и синтеза АТФ (рис. 9). Так концентрация 100 мкг/мл снижает этот показатель почти в 5,4, а 50 мкг/мл – в 2,9 раз.

Рис. 9. Влияние дельта-эндотоксина на синтез АТФ в клетках HeLa

В течение первых 10 мин синтез АТФ постепенно снижается в 7,2 и 4 раза, соответственно, а затем резко падает через 15 мин в 22 и 11,4 раза, соответственно. Через 60 мин инкубации потребление АДР составляет только 0 % (100 мкг/мл) и 0,4 % от нормы.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»