WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |


На правах рукописи

КаМЕНЕК ДМИТРИЙ ВАЛЕРЬЕВИЧ

ДЕЙСТВИЕ ДЕЛЬТА-ЭНДОТОКСИНА BACILLUS THURINGIENSIS НА ПЕРЕВИВАЕМЫЕ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК

Специальность

03.00.07 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Казань, 2009

Работа выполнена на кафедре общей и биологической химии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Ульяновский государственный университет

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор,

член-корр. АН Татарстана

Ильинская Ольга Николаевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Алимова Фарида Кашифовна (зав.кафедрой биохимии Казанского государственного университета им. В.И. Ульянова - Ленина,г. Казань).

доктор биологических наук, профессор

Васильев Дмитрий Аркадьевич (зав.кафедрой микробиологии, вирусологии, эпизоотологии, ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии)

Ведущая организация: ФГОУ ВПО Cаратовский государственный университет им. Н.Г.Чернышевского

Защита диссертации состоится «___» ____________ 2009 года в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при ГОУ Казанский государственный университет имени В.И. Ульянова-Ленина, по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлёвская, 18, аудитория 211.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского государственного университета им. В.И. Ульянова

Автореферат разослан «___» ______________ 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор З.И. Абрамова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы: Bacillus thuringiensis является широко распространенной в природе кристаллофорной спорообразующей бактерией. Известны ее энтомопатогенные свойства и промышленные препараты на основе бактерии являются наиболее важными средствами биологического контроля численности насекомых во многих странах.

Известно, что основным действующим началом B. thuringiensis, ответственным за комплекс патологических проявлений в организме чувствительного насекомого, является дельта – эндотоксин, продуцируемый ею. Показана также антимикробная активность дельта-эндотоксинов B.thuringiensis для различных бактерий и микроскопических грибов (Юдина и Бурцева, 1997; Климентова, 2001; Тюльпинева, 2003; Каменек и соавт., 2005). Отмечали кроме того селективное ингибирующее действие белков кристаллов subsp. thuringiensis на развитие опухолевых клеток млекопитающих, в том числе человека (Prasad & Shethna, 1976; Ito et al., 2004). Эндотоксины предпочтительно убивали раковые клетки HeP, не оказывая влияния на развитие нормальных клеток. Все это дает основание предположить, что B. thuringiensis и её кристаллический дельта-эндотоксин являются важным универсальным высокоизбирательным природным регулятором численности самых различных организмов.

Создание и применение средств на основе дельта-эндотоксина позволило бы не только обеспечить максимальную эффективность и экологическую безвредность мероприятий по защите растений от вредных насекомых и фитопатогенных микроорганизмов, но и, возможно, решить целый ряд медицинских и ветеринарных проблем. Прежде всего, разработать препаративные формы, обладающие антимикробной и противораковой активностью и не токсичные для нормальных клеток. Их разработке должны предшествовать исследования, выполненные на культурах клеток.

В мировой литературе накоплен обширный материал, описывающий строение, состав, физико-химические свойства кристаллов. Установлено, что дельта-эндотоксины способны связываться с чувствительными рецепторами на цитоплазматических мембранах клеток кишечного эпителия, а затем проникать в них, формируя каналы-поры (Hodgman & Ellar, 1990; Smith & Ellar, 1994). Изучены особенности механизма действия на насекомых, включая клеточные культуры. Отмечается нарушение транспорта ионов, активирование АТPаз, снижение синтеза АТФ на фоне усиления потребления кислорода, разобщение процессов окислительного фосфорилирования и дыхания (Heimpel, 1977; Faust, 1984; Aronson et al., 1986; Gill et al., 1992; Himeno et al., 1985; Каменек, 1998). Проведены также исследования влияния на млекопитающих кристаллов белкового дельта-эндотоксина, которые подтвердили, что эти белки и продукты их расщепления не токсичны и не аллергенны для теплокровных организмов (Киль и Надыкта, 2002). Вышесказанное позволило определить цель и задачи исследования.

Цель настоящего исследования – охарактеризовать по морфологическим и биохимическим параметрам этапы действия дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis subsp. sotto и выявить особенности механизма его действия на клетки перевиваемых линий HeLa, B16 и L1210.

Основные задачи исследования:

1. Выявить общее цитопатическое действие дельта-эндотоксина и охарактеризовать силу его эффекта по отношению к клеткам перевиваемых линий HeLa, B16 и L1210.

2. Определить влияние дельта-эндотоксина на ионный гомеостаз клеточных линий, установив факт нарушения транспорта основных неорганических ионов (K+, Na+, Ca2+ и Mg2) вследствие изменения активности основного ионного транспортера - K+, Na+- АТФазы.

3. Установить возможность действия дельта-эндотоксина как агента, разобщающего дыхание и фосфорилирование в клетках перевиваемых культур

4. Проанализировать влияние дельта-эндотоксина на процесс гликолиза в клетках HeLa согласно показателям активности основных ферментов гликолиза – 3-фосфоглицерат дегидрогеназы и лактат дегидрогеназы.

5. Охарактеризовать ранние и поздние этапы действия дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis subsp. sotto

Научная новизна результатов исследований. Впервые проведено изучение влияния дельта-эндотоксина B. thuringiensis на клетки перевиваемых культур (HeLa, L1210, B16). Показано, что изученные культуры отличаются по чувствительности к токсину. Установлена прямо пропорциональная зависимость их чувствительности от времени контакта с токсином и его концентрации.

Показано, что действие дельта-эндотоксина на культуры раковых клеток, аналогично таковому для клеток кишечника и культур насекомых. Установлено нарушение работы ион транспортирующей Mg2+-зависимой АТФазной системы, результатом которого является пассивный нерегулируемый приток ионов натрия и воды в клетку и, как следствие, вакуолизация мембранных структур. Показана первичность активирования фермента (в течение первых 10 мин) по отношению к изменению концентраций ионов, которое начиналось только через 10-15 мин.

Установлено, усиление клеточного дыхания в течение первых 10 минут воздействия дельта-эндотоксина на фоне резкого снижения синтеза АТР, которое, вероятно, связано с разобщением окислительного фосфорилирования и дыхания, приводящего к деэнергизации митохондрий и клеток в целом.

Установлено начальное усиление гликолиэа, очевидно связанное с необходимостью компенсации снижения синтеза АТР в ходе окислительного фосфорилирования, за счет аэробной, а при дальнейшей деэнергизации клетки, и снижении потребления кислорода анаэробной стадии гликолиза. Это подтверждает динамика изменения активности 3-фосфорглицерат дегидрогеназы и лактат дегидрогеназы, ферментов катализирующих из ключевых стадий гликолитического процесса.

Установлено, что нарушение транспортных функций клеточных мембран и, вслед за этим, их целостности вызывает выход лактатдегидрогеназы во внеклеточную жидкость и значительное повышение содержания лактата в ней.

Практическая значимость работы. Полученные результаты могут быть использованы при разработке препаративных форм для лечения различных форм онкологических заболеваний человека и домашних животных, а так же при оценке безопасности применения эндотоксинсодержащих пестицидов. Полученные результаты могут быть использованы в учебном процессе как вносящие вклад в представления о механизмах действия бактериальных токсинов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Цитопатический эффект дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. sottо связан с изменением структуры клеток (нарастающая вакуолизация с последующим разрушением), пропорционален его концентрации и времени контакта с клетками перевиваемых культур. Эффективность действия токсина различается по силе для разных клеточных линий: чувствительность клеток HeLa значительно выше, чем клеток B16 и L1210.

2. Действие дельта-эндотоксина характеризуется нарушением транспорта ионов K+, Na+, Ca2+ и Mg2+ через цитоплазматическую мембрану клеток, которому предшествует значительная (до 6,8 раз) активация Mg2+-зависимой K+, Na+- АТФазы.

3. Дельта-эндотоксин угнетает синтез АТФ на фоне активации дыхания, действуя на культуры клеток аналогично разобщителям процессов окислительного фосфорилирования и дыхания.

4. Проявлением действия дельта-эндотоксина является интенсификация гликолиза в клетках HeLa на начальном этапе и активация 3-фосфоглицерат дегидрогеназы с последующим ее угнетением, сменяемым активацией характерного для анаэробного режима гликолиза фермента – лактат дегидрогеназы.

5. Разрушению клеток под действием дельта-эндотоксина предшествует, деэнергизация митохондрий, снижение потребления кислорода, активациея анаэробного пути гликолиза, нарушение целостности мембран и выход лактат дегидрогеназы во внеклеточную среду.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на симпозиуме с международным участием «Актуальные проблемы адаптации к природным и экосоциальным условиям среды» (Ульяновск, 2002), XIII Международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение» (Казань, 2005); Всероссийской школе-семинаре молодых ученых и специалистов по актуальным проблемам «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2004 - 2006); Всероссийской конференции молодых ученых и специалистов (Москва, МГУ, 2007); Регионального научного семинара Министерства образования РФ « Геоэкологические проблемы Среднего Поволжья» (Ульяновск, 2008), Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008), межкафедральных семинарах экологического факультета Института медицины, экологии и физической культуры Ульяновского госуниверситета (2003 – 2008).

Публикации результатов исследований. Основные положения опубликованы в 14 работах.

Объем диссертационной работы. Диссертационная работа изложена на 131 странице компьютерного набора, включает 12 таблиц и 12 рисунков. Диссертация состоит из введения, 3 глав, включающих обзор литературы, материалов и методов исследований результаты исследований и их обсуждение с учетом существующих в литературе данных, заключения, выводов и списка литературы. Список цитируемой литературы содержит 270 источников, в том числе 91 на русском языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДы ИССЛЕДОВАНИЙ

В соответствии с поставленной задачей нами были изучено действие дельта-эндотоксинов различных штаммов B. thuringiensis subsp. galleriae, alesti, kurstaki, thuringiensis, sotto, dendrolimus, (Cry IA класса), на клетки HeLa, L1210, B16 и SCLd-135.

Кристаллы растворяли 0,04 М NaOH, затем рН снижали до 7,8 осторожным титрованием 0,1 М HCl. Кристаллы предварительно отделяли от спор в двухфазной системе: хлороформ – водный раствор Na2SO4 (Cooksey, 1968). Разделение полипептидов проводили методом хроматографии на колонке Sephadex-G-200 размером 2,5410 см. Уровень белка определяли по методике. Для дальнейшей работы собирали фракции с Мr выше 60000 Д. Очистку дельта-эндотоксинов завершали микрофильтрацией через бактериальные фильтры, которая являлась одновременно и стерилизацией.

Для световой микроскопии препараты фиксировали в фиксаторе Карнуа и окрашивали кристаллическим фиолетовым (Пирс, 1962). Содержание неорганического фосфата определяли по методу Самнера (1989).

Концентрацию ионов измеряли с помощью атомно-адсорбционного спектрофотометра марки С-115. Поглощение кислорода изучали микроманометрическим методом (Travers et al., 1976).

Активность ферментов определяли спектрофотометрически после экстракции 0,1 М фосфатным буфером, рН 7,3 (лактат дегидрогеназа) или 0,1М карбонатным буфером, рН 9,8 (3-фосфоглицерат дегидрогеназа) при -4°C в течение 30 мин (Клунова и Банников, 1980). Активность Mg2+-зависимой АТФазы устанавливали по выделению неорганического фосфата (Фн) из АТФ в результате реакции ферментативного гидролиза (Писарева, 1968).

Достоверность всех полученных результатов оценивали методами математической статистики с помощью электронных таблиц Microsoft Excel.

2. Результаты и их обсуждение

2.1. Цитопатическая активность дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis

Согласно данным литературы, оптимальными концентрациями, позволяющими выявить различия в действии токсина, являются 5-15 мкг/мл. Нами была выбрана минимальная из указанных концентрация, заведомо не приводящая к полному разрушению клеток. Инкубацию в присутствие токсина осуществляли в течение 60 мин.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»