WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Все использованные лиганды оказывали стимулирующее влияние на выработку ФНО МНК здоровых доноров I и II групп. Проанализировав КС в обеих группах, мы не обнаружили статистически значимых различий в КС различных лигандов TLR в двух группах здоровых доноров. Учитывая также, что высокая спонтанная выработка ФНО может быть следствием вирусной инфекции, стрессовых воздействий и др, в качестве контрольной группы в дальнейшем мы рассматривали здоровых доноров I группы (рис. 2).

Максимальным стимулирующим эффектом обладают лиганды TLR1/2 и TLR2/6 – пептидогликан и зимозан, соответственно, а также лиганд TLR4 – ЛПС. Меньшей стимулирующей активностью на выработку ФНО обладают лиганды TLR5 и TLR9.

В группе здоровых людей выявлены индивидуальные особенности профиля стимулированной лигандами TLR выработки ФНО. У одних доноров максимальное количество ФНО вырабатывается при стимуляции МНК зимозаном и пептидогликаном, в то время как показатели, полученные при стимуляции ЛПС, флагеллином и CpG сравнимы с контролем. Максимальная выработка ФНО МНК других доноров выявляется под влиянием ЛПС или в ответ на флагеллин и CpG.

Индивидуальные различия выработки ФНО среди здоровых доноров могут определяться несколькими причинами: различной экспрессией TLR на МНК, полиморфизмом генов как TLR, так и ФНО, исходным функциональным состоянием клеток, участвующих в синтезе ФНО и других цитокинов.

Рисунок 2. Показатели коэффициентов стимуляции выработки ФНО МНК здоровых доноров в ответ на оптимальные дозы лигандов TLR.

Для оценки действия исследуемых нами лигандов TLR на индукцию ИФН I типа МНК здоровых доноров мы исследовали влияние лигандов TLR на выработку ИФН-, который вместе с ИФН- принадлежит к интерферонам I типа. В основном синтез ИФН- индуцируется под действием паттернов вирусного происхождения, таких как одно- и двухцепочечная РНК, вирусная или бактериальная ДНК, а также лигандами TLR4.

Спонтанная выработка ИФН- в группе здоровых доноров (n=10) составила 29,94±9,78 пг/мл. Стимулированную лигандами TLR выработку ИФН- оценивали также как и для ФНО, в КС. Выработка ИФН- стимулиро-

валась под действием ЛПС, P(I:C) и CpG, причем воздействие CpG оказывало наибольший стимулирующий эффект (рис. 3). Зимозан и флагеллин не оказывали существенного влияния на выработку ИФН-. Индивидуальных особенностей в выработке ИФН- МНК здоровых доноров нами выявлено не было.

Рисунок 3. Показатели коэффициентов стимуляции выработки ИФН- МНК здоровых доноров под действием оптимальных доз лигандов TLR.

Таблица 1. Показатели коэффициентов стимуляции выработки ФНО МНК здоровых доноров в ответ на оптимальные дозы лигандов TLR.

Концентрация лиганда, мкг/мл

Пептидогликан

2,5

Зимозан

10,0

ЛПС

0,1

Флагеллин

0,5

P(I:C)

10

ОДН CpG 1,0

Спонтанная

выработка, пг/мл

Группа I

5,33±1,39*

5,86±2,33*

4,02±1,99*

1,89±0,52*

3,82±0,53*

1,83±0,58*

46,74±26,53

Группа II

2,13±1,19

5,22±2,77*

3,47±1,29*

1,98±0,66*

2,24±0,18*

1,83±1,09*

261,86±111,08

Данные в таблице представлены в КС. * - сравнение стимулированной и спонтанной выработки ФНО в каждой группе доноров по критерию Вилкоксона, р<0,05.

Таким образом, определение выработки ИФН- под влиянием лигандов TLR не дает возможности провести полную оценку стимулирующей активности всех используемых нами основных лигандов TLR, но проведение данного исследования параллельно с изучением выработки ФНО позволяет получить дополнительную информацию о функциональной активности клеток, экспрессирующих TLR.

На следующем этапе работы оценивали спонтанную и стимулированную продукцию ФНО и ИФН- у больных ПИД с дефектами антителообразования:

  • Группа I больных ОВИН – состояла из 9 человек (4 женщины и 5 мужчин) в возрасте от 20 до 45 лет;
  • Группа II больных ОВИН – состояла из 14 детей (3 девочки и 11 мальчиков) в возрасте от 6 до 17 лет.
  • Группа III больных Х-АГГ – состояла из 13 мальчиков в возрасте от 5 до 17 лет.

ОВИН и Х-АГГ характеризуются низким содержанием сывороточных иммуноглобулинов и основными осложнениями данных ПИД являются хронические бактериальные инфекции, преимущественно респираторного и желудочно-кишечного тракта. ОВИН является гетерогенной группой, отличающейся многообразием клинических проявлений. Патогенез ОВИН обусловлен множественными дефектами и адаптивного, и врожденного иммунитета [Schaffer et al, 2007; Kopecky, Lukesova, 2007; Amoras et al, 2007; Bayry et al, 2005]. В основе патогенеза Х-АГГ лежит нарушение дифференцировки В-лимфоцитов, вызываемое мутацией гена btk, кодирующего В-клеточную тирозинкиназу.

Во всех группах больных ПИД выявлена повышенная спонтанная продукция ФНО по сравнению с группой здоровых доноров (табл. 2). Все использованные нами лиганды TLR оказывали стимулирующее влияние на продукцию ФНО МНК больных ОВИН I и II групп. Однако при анализе КС лигандов TLR мы выявили нарушения в обеих группах больных ОВИН. Данные представлены в табл. 3.

Таблица 2. Спонтанная выработка ФНО МНК больных ОВИН, Х-АГГ и здоровых доноров.

Больные

Х-АГГ

Больные ОВИН,

группа I

Больные ОВИН, группа II

Здоровые доноры, группа I

Концентрация ФНО, пг/мл

298,54±153,09

581,19±271,74*

209,74±124,01

46,74±26,53*

* - сравнение по непараметрическому критерию Манна-Уитни с группой больных Х-АГГ, р<0,05.

Выявленные нарушения выработки ФНО МНК больных в ответ на лиганды TLR2 и TLR4 могут лежать в основе повышенной чувствительности больных ОВИН и Х-АГГ к грамположительным и грамотрицательным микроорганизмам. Известно, что наиболее частыми возбудителями инфекции у больных ОВИН и Х-АГГ являются Наemophilus influenzae и Streptococcus pneumoniae.

Дефекты гуморального звена приобретенного иммунитета больных ОВИН приводят к развитию хронических бактериальных инфекций. Тогда как развитие клеточного иммунного ответа у данных больных считается сохранным и, по всей видимости, лежит в основе устойчивости к вирусным инфекциям. ИФН- является одним из основных факторов противовирусной защиты организма, поэтому мы проанализировали спонтанную и стимулированную лигандами TLR выработку цитокина МНК периферической крови больных ОВИН.

Спонтанная продукция ИФН- МНК периферической крови больных ОВИН оказалась значительно ниже по сравнению с группой здоровых доноров и составила 5,41±0,87 пг/мл в группе I, и в группе II – 6,45±3,1 пг/мл.

Поскольку стимулирующей активностью на выработку ИФН- МНК периферической крови здоровых доноров в наших экспериментах обладают

Таблица 3. Показатели коэффициентов стимуляции выработки ФНО МНК больных ПИД в ответ на оптимальные дозы лигандов TLR.

Концентрация

лиганда, мкг/мл

Пептидогликан

2,5

Зимозан

10,0

ЛПС

0,1

Флагеллин

0,5

ОДН CpG

1,0

Спонтанная

выработка ФНО, пг/мл

Больные

Х-АГГ

2,61±1,17#

1,01±0,39#

1,61±0,47#

1,63±0,89

1,81±1,00

298,54±153,09

Больные ОВИН, группа I

2,44±0,69#

Н.о.

1,78±0,65*

1,45±0,36

1,49±0,51

581,19±271,74*

Больные ОВИН, группа II

2,27±0,61#

2,33±1,1#

1,92±0,47*

1,56±0,69

1,54±0,69

209,17±124,01*

Здоровые доноры, группа I

5,33±1,39

5,86±2,33

4,02±1,99

1,82±0,64

1,83±0,58

46,74±26,53

КС – коэффициенты стимуляции. Н.о. – не определяли.

* - сравнение по непараметрическому критерию Манна-Уитни с группой здоровых доноров, р<0,01

# - сравнение по непараметрическому критерию Манна-Уитни с группой здоровых доноров, р<0,05

лиганды TLR3, TLR4 и TLR9, МНК периферической крови больных ОВИН активировали P(I:C), ЛПС и ОДН CpG. У больных ОВИН I и II группы КС ЛПС, P(I:C) и CpG статистически значимо отличаются от показателей в группе здоровых доноров. Причем у детей КСЛПС выше как по сравнению с взрослыми больными, так и со здоровыми донорами (рис. 4). Полученные результаты свидетельствуют о дисбалансе в продукции цитокинов (ФНО и ИФН-), с которым могут быть связаны особенности клинической картины больных ОВИН.

Рисунок 4. Показатели коэффициентов стимуляции выработки ИФН- МНК здоровых доноров и больных ОВИН под действием оптимальных доз лигандов TLR.

В литературе не описаны прямые молекулярные дефекты, свидетельствующие о нарушениях функционирования TLR в клетках больных ОВИН. На основании полученных нами данных о нарушенном ответе МНК периферической крови на стимуляцию лигандами TLR, мы можем предполагать о существовании дефекта системы TLR у больных ОВИН.

Снижение стимуляции ФНО в ответ на лиганды у больных ОВИН и Х-АГГ может быть связано с нарушением экспрессии TLR.

Следующим этапом нашей работы стало исследование экспрессии TLR2 и TLR4 на поверхности моноцитов периферической крови человека.

Процент моноцитов, несущих на своей поверхности CD14 антиген, у больных ОВИН статистически значимо не отличался от значения показателя в группе здоровых доноров, тогда как средняя интенсивность флуоресценции СD14 на моноцитах больных была ниже по сравнению с группой здоровых доноров. Также не было выявлено значимых отличий в проценте CD14+TLR2+ и CD14+TLR4+ моноцитов. Однако средняя интенсивность флуоресценции TLR2 и TLR4 на поверхности СD14-положительных моноцитов была ниже у больных ОВИН в I и II группах по сравнению с группой здоровых доноров (табл. 3 и 4).

Анализируя экспрессию TLR2 и TLR4 на СD14-положительных моноцитах больных Х-АГГ, мы не выявили изменения содержания CD14+TLR2+ и CD14+TLR4+ моноцитов, но средняя интенсивность флуоресценции TLR2, TLR4 и CD14 ниже по сравнению с группой здоровых доноров (табл. 4 и 5).

Выявленное нами снижение экспрессии TLR на моноцитах больных ПИД с дефектами антителообразования, в клинической картине которых наблюдаются рецидивирующие хронические бактериальные инфекции, что может быть обусловлено полиморфизмом или мутациями в генах TLR, нарушением процессов транскрипции и трансляции продуктов этих генов, а также нарушением регуляции поверхностной экспрессии молекул. Известно, что цитокины участвуют в регуляции экспрессии TLR. Возможно, различные лекарственные препараты также оказывают влияние на уровень экспрессии TLR и их корецепторов на поверхности клетки.

Согласно литературным данным у больных с бактериальными и вирусными инфекциями экспрессия TLR2, TLR4 и корецепторных молекул на лейкоцитах периферической крови (моноцитах, дендритных клетках, нейтрофилах и др.) возрастает [Miyazaki et al, 2008; Sato et al, 2007; Orihara et al, 2007]. Таким образом, снижение плотности экспрессии TLR2 и TLR4 на моноцитах больных ОВИН вносит свой вклад в развитие клинической картины, наблюдаемой у этих больных ОВИН.

Таблица 4. Экспрессия CD14 и TLR2 на поверхности моноцитов периферической крови больных ПИД и здоровых доноров.

% CD14+

% СD14+TLR2+

СИФ CD14

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»