WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

ВАРИВОДА Анна Сергеевна

РЕЦЕПТОРЫ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА: АССОЦИИРОВАННЫЕ С TOLL-ПОДОБНЫМИ РЕЦЕПТОРАМИ ФУНКЦИИ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ В НОРМЕ И ПРИ ПЕРВИЧНЫХ ИММУНОДЕФИЦИТАХ

14.00.36 – аллергология и иммунология

Автореферат

на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва – 2008

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Леонид Васильевич Ковальчук

Научный консультант:

кандидат медицинских наук Марина Викторовна Хорева

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Марина Александровна Стенина

Российский Государственный Медицинский Университет

доктор медицинских наук, профессор Леонид Петрович Алексеев

Институт иммунологии ФМБА России

Ведущая организация:

Московская медицинская академия И.М. Сеченова

Защита диссертации состоится «22» сентября 2008 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.05 при Российском государственном медицинском университете по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Университета по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д.1

Автореферат разослан «14» июля 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук, доцент Т.Е. Кузнецова

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

В настоящее время одной из наиболее актуальных проблем фундаментальной и клинической иммунологии является изучение врожденного иммунитета. Врожденный иммунитет является первой линией защиты организма от патогенов. Он реализуется через клеточные и гуморальные факторы. Факторы врожденного иммунного ответа предсуществуют или индуцируются быстро (минуты, часы) после инфекции. Компоненты врожденного иммунного ответа не изменяются в процессе жизни организма, контролируются генами зародышевой линии и передаются по наследству.

Важным компонентом системы врожденного иммунитета являются паттерн-распознающие рецепторы (ПРР), участвующие в распознавании консервативных молекулярных структур микроорганизмов, так называемых PAMP (паттерны, ассоциированные с микроорганизмами).

Реализация специфичности врожденной иммунной системы ложится, в большей степени, на семейство эволюционно консервативных рецепторов, известных как Toll-подобные рецепторы (TLR), которые играют решающую роль в ранней защите организма от патогенов. TLR являются сигнальными ПРР и рассматриваются исследователями, как ключевые рецепторы врожденного иммунитета [R.Medzhitov, CJ Janeway, 1997]. Изучение TLR выявило связь между врожденным и приобретенным иммунитетом. Распознавание микробных компонентов TLR инициирует активацию сигнальных путей, в результате чего происходит экспрессия генов цитокинов (ФНО, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-12, ИФН/ и других), костимуляторных молекул и некоторых других генов. Продукты этих генов контролируют систему врожденного иммунитета и, в дальнейшем, направляют развитие адаптивного иммунного ответа [T.Kawai, S.Akira, 2007, L.C. Parker et al, 2007, F. Sandor et M. Buc, 2005]. Характер и интенсивность ответа, опосредуемого TLR, определяется несколькими компонентами, составляющими систему TLR. Система TLR включает лиганды TLR, сами рецепторы (гены, кодирующие TLR, мРНК, белок), молекулы, осуществляющие трансдукцию сигнала – адаптерные белки, а также эффекторные молекулы, которые вырабатываются в результате активации TLR и опосредуют их дальнейшие эффекты.

В последние годы накапливается все больше сведений о патологиях, связанных с Toll-подобными рецепторами. Широкий спектр лигандов TLR и представленность этих рецепторов на большинстве клеток организма способствуют вовлечению TLR в патогенез многих заболеваний. Дефекты в системе TLR: нарушения распознавания лигандов, экспрессии TLR, трансдукции сигнала, выработки эффекторных молекул, а также полиморфизм генов TLR могут приводить к развитию тяжелых инфекционных заболеваний (сепсис, менингит), аутоиммунных заболеваний, атеросклероза, аллергопатологии и др. Выявленные дефекты молекул, участвующих в трансдукции сигнала от TLR, лежат в основе повышенной восприимчивости к инфекциям, как, например, у больных с дефектом гена, кодирующего IRAK4 киназу.

Для выявления состояний, связанных с нарушением функционирования системы TLR необходимы адекватные и надежные методы оценки компонентов системы TLR, которые могут быть воспроизведены в условиях стандартной клинической лаборатории.

Первичные иммунодефициты с дефектами антителообразования (ОВИН и Х-АГГ) характеризуются частыми реккурентными бактериальными инфекциями. Иммунопатогенез ОВИН до конца не ясен. Нарушения, выявляемые при ОВИН, вызваны множественными дефектами иммунной системы и на данный момент нет единого мнения о молекулярных механизмах этих нарушений. В последнее время в литературе появляются данные о дефектах созревания антигенпрезентирующих клеток у больных ОВИН [Bayry J. et al, 2004, Cunningham-Rundles C., Radigan L., 2005, Yong P.F. et al, 2008]. Изучение механизмов нарушений функционирования врожденной иммунной системы у этих больных позволит прояснить иммунопатогенез ОВИН.

На кафедре иммунологии РГМУ (зав. кафедрой – профессор Л.В. Ковальчук) с 2005 года проводится работа по оценке системы TLR в норме и при различных иммунопатологических состояниях.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Изучить функциональное состояние экспрессирующих TLR мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров и больных первичными иммунодефицитами с дефектами антителообразования.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

  1. Отработать оптимальные условия оценки функциональной активности МНК периферической крови человека, экспрессирующих TLR in vitro.
  2. Оценить эффективность действия различных лигандов TLR на цитокинсинтезирующую функцию МНК периферической крови здоровых доноров.
  3. Изучить влияние лигандов Toll-подобных рецепторов на выработку ФНО МНК периферической крови больных ПИД с дефектами антителообразования (ОВИН и Х-АГГ).
  4. Оценить экспрессию TLR на поверхности моноцитов периферической крови здоровых доноров и больных ОВИН и Х-АГГ методом проточной цитофлуорометрии.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Работа содержит новые данные о дефектах в системе Toll-подобных рецепторов у больных ПИД с дефектами антителообразования (ОВИН и Х-АГГ). Показано, что при данных ПИД нарушена выработка ФНО в ответ на стимуляцию лигандами TLR2 и TLR4. Выявлен дисбаланс индуцированной лигандом TLR4 ЛПС выработки ФНО, ИЛ-12 и ИФН- МНК больных ОВИН.

Показаны различия в экспрессии TLR2 и TLR4 на моноцитах периферической крови здоровых доноров и больных ПИД с дефектами антителообразования. Обнаружены различия количества моноцитов, несущих на своей поверхности исследуемые TLR, у здоровых доноров и больных ПИД и плотности экспрессии TLR2 и TLR4 на одной клетке.

Полученные данные позволяют предположить, что дефекты созревания антигенпрезентирующих клеток, выявляемые у больных ОВИН, могут быть связаны с нарушениями в системе TLR.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

В данной работе определены оптимальные условия оценки цитокинсинтезирующей функции активированных лигандами TLR МНК периферической крови здоровых доноров и больных с иммунопатологией. Оценена выработка ФНО и ИФН- МНК в ответ на лиганды TLR у здоровых доноров. Выявлено, что максимальным стимулирующим влиянием на выработку ФНО МНК обладают лиганды TLR2 и TLR4, а на выработку ИФН- лиганды TLR4, TLR3 и TLR9. Полученные данные позволяют оценить состояние рецепторов врожденного иммунитета у больных с иммунопатологией. У больных ПИД с дефектами антителообразования в ходе настоящего исследования выявлено снижение выработки ФНО в ответ на лиганды TLR2 и TLR4 и нарушение экспрессии TLR2 и TLR4 на моноцитах больных ОВИН, что свидетельствует о новых молекулярных дефектах в системе врожденного иммунитета у больных ОВИН и позволяет уточнить иммунопатогенез ОВИН.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты исследований внедрены в учебный процесс на кафедре иммунологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, используются в практике лечебно-диагностической работы в отделении клинической иммунологии РДКБ.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертационной работы докладывались на научных заседаниях кафедры иммунологии и отдела иммунологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, в 2005 году на Конференции молодых ученых Института иммунологии, в 2006 году на II Всероссийском конгрессе по детской аллергологии и иммунологии, в 2007 году на VI Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии», в 2006, 2007 и 2008 году в Москве на XIII, XIV и XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» и на Объединенном иммунологическом форуме (г. Санкт-Петербург, 2008).

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 125 cтраницах машинописного текста, содержит 23 таблицы и 40 рисунков. Библиографический указатель включает 11 отечественных и 149 иностранных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В ходе исследования проведено обследование 31 больного с ПИД и 37 здоровых доноров. Критерием отбора доноров было отсутствие инфекционных и аллергических заболеваний. Всем больным первичными иммунодефицитами диагноз был поставлен в соответствии с диагностическими критериями, разработанными Европейским обществом иммунодефицитов (ESID).

Методы исследования. Источником МНК служила гепаринизированная венозная кровь обследованных доноров и больных. Фракция мононуклеарных клеток выделялась на градиенте плотности фиколл-урографина 1,077 г/мл. После выделения оценивалась жизнеспособность клеток окрашиванием 0,1% раствором трипанового синего.

Для культивирования мононуклеарных клеток использовали 24-луночные планшеты «Costar». Культивирование проводили при t 370С в атмосфере 5% CO2 в термостате. В качестве питательной среды использовали RPMI 1640 с добавлением инактивированной телячьей эмбриональной сыворотки, 300 мкг/мл L-глутамина и 0,02 M HEPES-буфера и 100 мкг/мл гентамицина. Рабочая концентрация клеток составляла 1х106/мл. В качестве лигандов TLR использовали следующие стимуляторы: ЛПС, зимозан, пептидогликан, Флагеллин, P(I:C) и ОДН CpG. Контролем служили МНК, культивируемые только в среде RPMI 1640 или в присутствии ОДН, не содержащего CpG последовательности. По окончании культивирования МНК осаждали центрифугированием. Полученные супернатанты хранили в течение 2-3 месяцев при -700С. Концентрацию цитокинов в полученных супернатантах определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА).

Экспрессию молекул на поверхности клеток оценивали методом проточной цитофлуориметрии с использованием МкАТ. Для определения экспрессии антигенов на поверхности моноцитов периферической крови МНК инкубировали с мечеными МкАТ в течение 30 мин при 4оС, отмывали при 1200 об/мин при 4оС и фиксировали раствором BD Cell Fix. Анализ образцов клеточных суспензий проводили на проточном цитометре Facscan (Becton Dickinson, США).

В каждом образце выявляли процент двойных позитивных (CD14+TLR2+ или CD14+TLR4+) клеток и количество ФИТЦ-меченых и ФЭ-меченых антител, оценивая интенсивность флуоресценции (ИФ).

Статистическую обработку данных проводили в программном пакете StatSoft Statistica. Результаты выражали как среднее арифметическое для анализируемой группы показателей ± стандартное отклонение. Для сравнения групп по количественным признакам использовали непараметрические критерии: U-критерий Манна-Уитни и критерий Вилкоксона. Различие групп полагали статистически значимым при P<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Активация TLR запускает сигнальный каскад, приводящий к активации NF-B, что, в свою очередь, приводит к синтезу ФНО и других провоспалительных цитокинов, таких как ИЛ-1, ИЛ-6 и др. ФНО – один из основных эффекторных цитокинов, обеспечивающих развитие воспалительной реакции.

На первом этапе работы мы оценивали спонтанную и стимулированную выработку ФНО МНК периферической крови здоровых доноров. В качестве стимуляторов продукции ФНО были выбраны пептидогликан, зимозан, ЛПС, флагеллин, P(I:C) и CpG, действующие через TLR1/2, TLR2/6, TLR4, TLR5, TLR3 и TLR9, соответственно.

При анализе спонтанной выработки ФНО МНК здоровых доноров нами были выявлены 2 группы: с нормальным и повышенным исходным уровнем секреции цитокина. Средняя спонтанная продукция ФНО в I группе доноров составила 46,74±26,53 пг/мл, а во II группе – 261,86±111,08 пг/мл (рис. 1). Группа I включает 30 человек, группа II – 7 человек.

Гетерогенность исходного уровня продукции цитокина известна также по литературным данным [Дьяконова В.А. и др., 2004, Deering RP,Orange JS, 2006]. Высокая спонтанная продукция ФНО может быть связана с предстимуляцией клеток in vivo, а также с физиологической гетерогенностью в группе здоровых доноров.

При исследовании влияния различных лигандов TLR на продукцию ФНО МНК принимали спонтанную выработку ФНО за 1 и стимулирующее влияние различных лигандов на продукцию ФНО оценивали, используя коэффициент стимуляции (КС). КС рассчитывали как отношение концентрации ФНО в супернатантах стимулированных лигандами МНК к концентрации ФНО в супернатантах нестимулированных МНК. Относительные единицы вводились для выявления прироста уровня цитокинов под действием лигандов по отношению к спонтанной выработке цитокинов, а также для повышения стандартизации метода.

На основании проведенных исследований, данных литературы и рекомендаций фирм производителей в дальнейшем для оценки функциональ-

Рисунок 1. Спонтанная продукция ФНО МНК периферической крови здоровых доноров.

ной активности клеток, экспрессирующих TLR, нами были отобраны оптимальные концентрации лигандов TLR: пептидогликан – 2,5 мкг/мл; зимозан – 10 мкг/мл; ЛПС – 0,1 мкг/мл; флагеллин – 0,5 мкг/мл; P(I:C) – 10 мкг/мл; ОДН CpG – 1,0 мкг/мл. Средние значения по выработке ФНО МНК здоровых доноров I и II групп под действием лигандов TLR представлены в табл. 1.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»