WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

Было выявлено ингибирующее влияние экспрессии гена rolC на активность H2O2-индуцируемых каналов, что не позволяет повышать содержание кальция в клетке при стрессовом воздействии. Это приводит к тому, что активность белков RcCDPK3 и RcRboh1, зависящая от наличия ионов кальция, не повышается. Малоактивный белок RcCDPK3 не активирует RcRboh1 посредством фосфорилирования. Изучив влияние гена rolC на экспрессию генов RcCDPK3 и RcRboh1, мы обнаружили, что происходит ее значительное понижение. При этом в RC-H культуре понижена экспрессия даже конститутивных форм генов RcRboh2 и RcRboh3.

Мы предполагаем, что все эти явления приводят к постоянному пониженному содержанию АФК в rolC-клетках марены. И, кроме того, препятствуют окислительному взрыву при воздействии температурного и солевого стрессов, что придает rolC-культурам марены повышенную устойчивость к этим воздействия по сравнению с нетрансгенной культурой или культурами, экспрессирующими другие гены rol.

Заключение

Экспрессия агробактериальных генов rol оказывает различные эффекты на трансгенные культуры. В основном исследователи уделяли внимание такому эффекту как активация вторичного метаболизма. В этом аспекте изучалось действие генов rolB и rolC и дикого штамма A. rhizogenes A4 (Moyano et al., 1999).

Известно, что вторичный метаболизм растений напрямую связан с системой патоген-индуцируемого защитного механизма (Тарчевский, 2002). Поэтому мы предположили, что совместная или индивидуальная экспрессия генов rolA, rolB и rolC в культуре растительных клеток способна повлиять не только на вторичный метаболизм, но и на устойчивость культур к неблагоприятным абиотическим воздействиям.

Нами было исследовано индивидуальное действие генов rolA, rolB и rolC с разным уровнем экспрессии трансгена в культуре клеток марены сердцелистной. Для выявления эффектов генов rol при их совместной экспрессии мы исследовали клеточные культуры марены, трансформированные диким штаммом A. rhizogenes A4 и конструкцией rolABC.

Нами было показано, что во всех rol-экспрессирующих культурах марены активирован биосинтез антрахинонов и повышен уровень экспрессии гена изохоризматсинтазы — ключевого фермента биосинтеза антрахинонов. В rolB- и rolC-культурах с разным уровнем экспрессии трансгена мы показали наличие положительной корреляции между интенсивностью экспрессии генов rolB и rolC и биосинтетическими показателями культур. Из полученных данных мы сделали вывод, что максимальная активация биосинтеза антрахинонов наблюдается при экспрессии гена rolB. Этот эффект был описан как для культур, экспрессирующих только ген rolB, так и для культур, экспрессирующих все три гена rol..

Исследовав влияние неблагоприятных абиотических воздействий на клеточные культуры марены, мы показали, что все rol-экспрессирующие культуры обладают повышенной устойчивостью к этим воздействиям. При этом наибольшую устойчивость к солевому и температурным стрессам показали культуры, экспрессирующие ген rolC, как индивидуально, так и совместно с генами rolA и rolB.

Таким образом, мы показали, что вышеописанные эффекты генов rolB (активация биосинтеза антрахинонов) и rolC (повышение устойчивости к негативным абиотическим воздействиям) сохраняются и при совместной их экспрессии в клетках RABC и RA4, но друг друга не усиливают.

Поскольку экспрессия генов rol в клеточных культурах марены приводит к активации биосинтеза антрахинонов, можно было ожидать, что при этом происходит значительное повышение содержания активных форм кислорода в трансгенных клетках. Однако, мы показали, что только индивидуальная экспрессия гена rolC оказывает влияние на содержание АФК. При этом экспрессия гена rolC не повышала, а напротив значительно понижала содержание АФК в клетках, в то время как индивидуальная экспрессия генов rolA и rolB на содержание АФК не влияла. Кроме того, была значительно снижена способность rolC-клеток генерировать окислительный взрыв в ответ на стрессовые воздействия. Такой эффект гена rolC был нейтрализован в культурах, экспрессирующих все три гена rol.

Мы предполагаем, что ингибирующее действие гена rolC на систему генерации АФК обеспечивает rolC-клеткам повышенную устойчивость к абиотическим стрессам. При этом можно предположить, что rol-опосредованная активация биосинтеза антрахинонов не связана с НАДФН-оксидазной сигнальной системой, как этого можно было ожидать.

Экспериментальные данные показали, что в rolC-культурах значительно снижена экспрессия генов НАДФН-оксидаз — основных источников АФК в клетке. Кроме того, мы показали, что экспрессия гена rolC оказывает влияние и на систему регуляции этого фермента: кальциевые каналы и RcCDPK3. Принимая во внимание данные о действии H2O2 на токи кальция в клетках культур R и RC-L (Шкрыль, 2006), мы предположили, что активность H2O2-индуцируемых кальциевых каналов в rolC-культуре марены значительно ингибирована. Экспрессия гена RcCDPK3 в культурах RC-L и RC-H так же значительно снижена, что, возможно, приводит к понижению активности патоген-индуцируемой изоформы НАДФН-оксидазы марены, как это было описано для StCDPK5 и НАДФН-оксидазы картофеля (StRBOHB) (Kobayashi et al., 2007).

В нашем исследовании мы обнаружили новый способ повышения устойчивости клеток растений к абиотическим стрессам за счет влияния трансгена rolC на метаболизм АФК. Был частично изучен предполагаемый механизм этого явления. Дальнейшее более детальное изучение rol-опосредованных эффектов на сигнальные системы клеток растений может иметь значение для управления защитным аппаратом растительного организма.

выводы

  1. Была получена трансгенная культура марены RABC, экспрессирующая совместно агробактериальные гены rolA, rolB и rolC.
  2. Для культур с разной интенсивностью экспрессии генов rolB и rolC — RB-L, RB-M, RB-H, RC-L, RC-M и RC-H было показано наличие положительной корреляции между уровнем экспрессии трансгенов и гена изохоризматсинтазы марены: r=0.839; P<0.001 и r=0.953; P<0.001, соответственно, где r — коэффициент корреляции.
  3. Клеточные культуры марены, экспрессирующие ген rolC, обладают повышенной устойчивостью к неблагоприятным абиотическим факторам по сравнению с контрольной культурой. Повышение устойчивости rolC-клеток к стрессовым воздействиям возможно связано с понижением их способности генерировать АФК в ответ на абиотический стресс
  4. С повышением уровня экспрессии гена rolC содержание активных форм кислорода в трансгенных клетках снижается по сравнению с контрольными клетками.
  5. Экспрессия гена rolC вызывает понижение экспрессии генов НАДФН-оксидаз марены, а так же ингибирующе влияет на систему регуляции патогениндуцируемой формы НАДФН-оксидазы.
  6. Эффекты экспрессии генов rolC (повышение устойчивости) и rolB (активация биосинтеза антрахинонов) сохраняются и при их совместной экспрессии в культурах RABC и RA4, но друг друга не усиливают.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах

1. Shkryl Y.N., Veremeichik G.N., Bulgakov V.P., Tchernoded G.K., Mischenko N.P., Fedoreyev S.A., Zhuravlev Y.N. Individual and Combined Effects of the rolA, B, and C Genes on Anthraquinone Production in Rubia cordifolia Transformed Calli // Biotechnology and Bioengineering. 2008. V. 100. P. 118-125.

2. Bulgakov V.P., Aminin D.L., Shkryl Y.N., Gorpenchenko T.Y., Veremeichik G.N., Dmitrenok P.S., Zhuravlev Y.N. Suppression of reactive oxygen species and enhanced stress tolerance in Rubia cordifolia cells expressing the rolC oncogene // Molecular Plant-Microbe Interaction. 2008. V. 21. № 12. P. 1561-1570.

Работы, опубликованные в материалах всероссийской и международной конференций

3. Шкрыль Ю.Н., Веремейчик Г.Н., Булгаков В.П. 2006. Гены rol стимулируют экспрессию изохоризматсинтазы в трансгенных культурах Rubia cordifolia // 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых. — Пущино. С. 406.

4. Veremeichik G.N., Shkryl Y.N., Gorpenchenko T.Y., Bulgakov V.P., Aminin D.L., Zhuravlev Y.N. 2008. ROS (reactive oxygen species) suppression induced by the Agrobacterium rhizogenes oncogene in Rubia cordifolia transformed cells // Taiwan-Russia bilateral symposium on plant biodiversity and bioactive natural products. — Taiwan. P. 107-115.

Веремейчик

Галина николаевна

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

ВЛИЯНИЕ АГРОБАКТЕРИАЛЬНЫХ ГЕНОВ ROLA, ROLB И ROLC НА УСТОЙЧИВОСТЬ К АБИОТИЧЕСКИМ ФАКТОРАМ И БИОСИНТЕЗ АНТРАХИНОНОВ В ТРАНСГЕННЫХ КУЛЬТУРАХ RUBIA CORDIFOLIA L.

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»