WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Характеристика трансгенных линий марены сердцелистной с разным уровнем экспрессии генов rolB и rolC. Для выявления индивидуального воздействия генов rolB и rolC мы исследовали три клеточные линии, экспрессирующие ген rolB — RB-L, RB-M и RB-H и три линии, экспрессирующие ген rolC — RC-L, RC-M и RC-H (от англ. low — низкий, moderate — средний, high — высокий). Трансгенность этих культур была доказана ранее (Шкрыль, 2006). Анализ экспрессии трансгенов показал, что экспрессия генов rolB и rolC максимальна в культуре RB-H и RC-H и минимальна в культурах RB-L и RC-L, соответственно. Экспрессия этих генов в культурах RABC и RA4 соответствует таковой в линиях RB-M и RC-M, соответственно. Уровень экспрессии гена rolA в культуре RA ниже, чем в культурах RABC и RA4 в 2 и 1.9 раза соответственно. Уровень экспрессии гена rolB в культуре RABC выше, чем в культуре RA4 в 1.53, а генов rolA и rolC значительно не различались.

Индивидуальное и совместное действие генов rol на рост культур, синтез антрахинонов и экспрессию гена изохоризматсинтазы. Накопление биомассы в культуре RA в 1.5 раза выше, чем в контрольной культуре. Экспрессия гена rolB приводила к ингибированию роста культур — 85% от контроля в культуре RB-L и 59% и 35% от контроля в культурах RB-M и RB-H, соответственно. Индивидуальная экспрессия гена rolC и совместная экспрессия генов rolA, rolB и rolC не оказали значительного влияния на рост культур RC-L, RC-M, RC-H, RABC и RA4 по сравнению с контролем (рис. 3, а). Содержание антрахинонов в RA культуре в 2.7 раза выше, чем в R культуре. Содержание антрахинонов в культурах RB-L, RB-M и RB-H в 2.8, 11.7 и в 14.8 раз, соответственно, превышает содержание антрахинонов в R культуре. Содержание антрахинонов в культурах RC-L, RC-M и RC-H в 2, в 3 и в 4.3 раза, соответственно, выше по сравнению с контрольной культурой. Совместная экспрессия генов rolA, rolB и rolC в RABC и RA4 привела к увеличению содержания антрахинонов в 6.5 и в 4.5 раза, соответственно, по сравнению с R культурой (рис. 3, б).

Изохоризматсинтаза (ICS) — это фермент, который направляет метаболиты шикимовой кислоты в биосинтез антрахинонов (Tegelen et al., 1999). Уровень экспрессии гена RcICS в культурах RB-M и RB-H выше, чем в R культуре в 13 и 9 раз, соответственно. В культурах RC-M и RC-H — в 2.5 и 4.5 раза, соответственно. В культурах RA, RB-L и RC-L экспрессия гена RcICS превышает экспрессию в R культуре в 2.3, в 2.1 и в 1.8 раза, соответственно. В культурах RABC и RA4 экспрессия гена RcICS выше, чем в R культуре в 7.2 и в 5.1 раза, соответственно (рис. 4, б). В культурах с разной интенсивностью экспрессии генов rolB и rolC — RB-L, RB-M, RB-H, RC-L, RC-M и RC-H выявлена положительная корреляция между уровнем экспрессии трансгенов и RcICS (r=0.839; P<0.001 и r=0.953; P<0.001, где r — коэффициент корреляции). Экспрессия генов rolC и rolA в культурах RABC и RA4 примерно одинаковая, при этом экспрессия гена rolB в культуре RABC выше, чем в культуре RA4 в 1.5 раза, что, по-видимому, привело к более высокому уровню экспрессии гена RcICS (в 1.6 раза) и более высокому содержанию антрахинонов в этой культуре (рис. 4).

Влияние генов rol на содержание активных форм кислорода в трансгенных клетках марены сердцелистной

Содержание активных форм кислорода в трансгенных культурах марены. Постоянная экспрессия генов rol в культуре клеток растений приводит к повышению экспрессии PR-белков (Kiselev et al., 2006) и активации биосинтеза фитоалексинов (Yoshikawa et al., 1987; Rhodes et al., 1990; Trypsteen et al., 1991; Palazn et al., 1998; Kiselev et al., 2007), к которым относятся и антрахиноны. Таким образом, rol-опосредованная активация биосинтеза антрахинонов в культурах марены является частью патоген-индуцируемого защитного механизма растений. Защитные реакции растений напрямую связаны с НАДФН-оксидазной сигнальной системой (Тарчевский, 2002) и с окислительным взрывом, в результате которого происходит быстрое образование активных форм кислорода (АФК) — супероксида аниона, перекиси водорода, синглетного кислорода и радикала гидроксила (Полесская, 2007).

Мы предположили, что экспрессия генов rol оказывает влияние на НАДФН-оксидазную сигнальную систему и на внутриклеточное содержание АФК. Измерения содержания АФК проводили посредством конфокальной микроскопии с помощью флуоресцентного зонда дихлорфлуоресцеина (DCF). Клетки культур марены нагружали DCF и наблюдали флуоресценцию зонда при его взаимодействии с АФК (рис. 5, а, б — зеленая флуоресценция). Интенсивность свечения исследуемых клеток соответствует содержанию АФК в цитоплазме этих клеток. Для подтверждения данных, полученных с помощью DCF зонда, был использован другой зонд — дигидрородамин 123 — R123. Этот зонд специфичен для АФК, генерируемых митохондриями клетки (рис. 5, а, б — розовая флуоресценция).

Содержание АФК в культурах RA, R-ABC, R-A4 и R существенно не различается. Флуоресценция зондов в культурах, экспрессирующих ген rolB, незначительно ниже, чем в контрольных клетках. Флуоресценция DCF и R123 в клетках RC-L и RC-H значительно ниже, чем в нетрансгенной культуре. Содержание АФК в культуре с высоким уровнем экспрессии трансгена гораздо ниже, чем в культуре с низкой его экспрессией. Таким образом, мы показали зависимость между степенью понижения содержания АФК и уровнем экспрессии гена rolC (рис. 5, а, б).

Воздействие абиотических факторов на rol-экспрессирующие культуры марены сердцелистной

Влияние температурного стресса на содержание активных форм кислорода в rolC-трансгенных культурах. При понижении или повышении температуры, засолении, воздействии тяжелых металлов, УВ-облучении и др., окислительный взрыв приводит к гибели клеток (Полесская, 2007). Более устойчивые к негативным абиотическим воздействиям формы растений обладают более высоким содержанием ферментов, участвующих в элиминировании кислородных радикалов (Browse, Xin, 2001; Jiang, Deyholos, 2006). Таким образом, чем меньше АФК продуцируют клетки растения в ответ на стрессовое воздействие, тем выше их устойчивость к этому воздействию (Kiraly et al., 2005).

Мы предположили, что пониженное содержание АФК оказывает положительное влияние на устойчивость rolC-клеток к световому и тепловому стрессу. Культуры RC-L и R были подвергнуты облучению аргоновым лазером (488 нм) с интенсивностью 5.9 % в течение 15.8 мин. При этом клетки нагружали зондом DCF и фиксировали накопление АФК. Облучение контрольной культуры привело к массивному окислительному взрыву на протяжении всего времени воздействия. Кривая накопления АФК в R культуре вышла на плато после 600 сек облучения. При этом облучение лазером культуры RC-L не привело к окислительному взрыву. При трехкратном увеличении интенсивности лазера было отмечено незначительное повышение содержания АФК в rolC-клетках. Кривая накопления АФК вышла на плато уже после 300 сек облучения (рис. 6). Такая особенность накопления АФК в rolC-клетках указывает на ингибирование процессов генерации АФК за счет действия продукта гена rolC. Другими словами, rolC-клетки не способны к генерации высокого уровня АФК даже при воздействии неблагоприятных факторов.

Влияние солевого стресса на содержание активных форм кислорода в rolC-трансгенных культурах марены. NaCl, ингибируя некоторые антиоксидантные ферменты, вызывает массированный окислительный взрыв, который в свою очередь приводит к гибели подвергшегося воздействию растения (Avsian-Kretchmer et al., 2004). Культуры R, RC-L и RC-H были подвергнуты воздействию 150 мМ NaCl в течение 30 мин. Затем клетки нагружали зондом DCF и наблюдали изменение флуоресценции по сравнению с контрольными клетками. В клетках R культуры было зафиксировано значительное повышение содержания АФК. В клетках культур RC-L и RC-H так же содержание АФК под воздействием NaCl повысилось. Но при этом содержание АФК в rolC клетках марены инкубированных с NaCl было меньше, чем в R клетках, не подвергнутых воздействию NaCl (рис. 7). Результаты этого эксперимента указывают на схожую способность культур R, RC-L и RC-H к нейтрализации продуктов окислительного взрыва и на пониженную способность rolC-культур к генерации АФК.

Изучение устойчивости rol-экспрессирующих культур марены к солевому стрессу. Нетрансгенную культуру R и трансгенные культуры RA, RB-L, RB-H, RC-L, RC-H, R-ABC и R-A4 выращивали на питательных средах с добавлением NaCl в различных концентрациях: 0, 20, 60 и 200 мМ. Концентрация NaCl, при которой гибнет 50% клеток (LD50) для культуры R оказалась самой низкой — 16.5 мМ. Для RB-L культуры LD50 составила 20мМ NaCl. Для RA и RB-H культур LD50 составила 23.5 и 26.8 мМ NaCl, соответственно. Культура RC-L более чем в 2 раза устойчивее культуры R — LD50 составила 36.7 мМ NaCl. Наибольшую устойчивость к солевому стрессу показала культура RC-H, для нее LD50 составил 69.8 мМ NaCl. Устойчивость к NaCl культур RABC и RA4, оказалась выше, чем у культуры RC-L, но ниже, чем у RC-H, и LD50 для них составила 45.6 и 41.7 мМ NaCl, соответственно. Возможно, это связано с тем фактом, что ген rolC в культурах RABC и RA4 экспрессируется на уровне культуры RC-M (рис. 8). Таким образом, мы показали, что максимальная устойчивость к солевому стрессу выявлена у культур, экспрессирующих ген rolC — RC-L, RC-H, R-ABC и RA4. При этом, чем выше уровень экспрессии трансгена, тем выше устойчивость культуры к NaCl.

Устойчивость rol-экспрессирующих культур марены к температурному стрессу. Другим абиотическим фактором, оказывающим стрессовое воздействие, является понижение или повышение температуры (Kratsch, Wise, 2000). Гибель растений при нефизиологических температурах, называют фотоокислительной смертью (Kiraly et al., 2005). Клеточные линии марены R, RA, RB-L, RB-H, RC-L, RC-H, R-ABC и R-A4 выращивали в условиях повышенной температуры (28oC) и при нормальной температуре (25oC). Результаты эксперимента показали наличие устойчивости к повышенной температуре у всех трансгенных культур. Менее устойчивой оказалась культура RB-L; прирост биомассы культур RA, RB-H и RC-L вдвое превышал прирост биомассы культуры R. Максимальная устойчивость была выявлена у культуры RC-H — прирост биомассы был в 4 раза выше, чем у нетрансгенной культуры R. Устойчивость культур RABC и RA4 занимает промежуточное положение между RC-L и RC-H культурами (рис. 9, а).

Культуры R, RB-L, RB-H, RC-L и RC-H выращивали в условиях пониженной (8oC) и при нормальной температурах (25oC). Культуры RB-L и RB-H оказались более устойчивы, чем R культура в 2.2 и 2.6 раза, соответственно. Устойчивость культур RC-L и RC-H в 4.6 и 6.2 раза, соответственно превышает устойчивость R культуры (рис. 9, б).

Повышение устойчивости к температурным стрессам по сравнению с R культурой присуще всем rol-экспрессирующим линиям марены; максимальная устойчивость отмечена для rolC-культур. Степень повышения устойчивости rolC-культур относительно R-культуры коррелирует с уровнем экспрессии трансгена.

Воздействие генов rol на НАДФН-оксидазную сигнальную систему

Влияние генов rol на кальциевую сигнальную систему в rol-экспрессирующих культурах марены. При неблагоприятных воздействиях содержание активных форм кислорода в растительной клетке значительно увеличивается, что приводит к окислительному взрыву (Hippeli et al., 1999). При этом запускается механизм генерации АФК ферментом НАДФН-оксидазой (Moshe, Robert, 2006; Sagi et al., 2006). Регуляция работы этого фермента осуществляется за счет кальциевой сигнальной системы, основными составляющими которой являются кальциевые каналы и кальцийзависимые протеинкиназы (CDPK). Активность кальциевых каналов обеспечивает присутствие в клетке кальция, необходимого для активирования НАДФН-оксидаз и CDPK. CDPK фосфорилируют определенные формы НАДФН-оксидаз, тем самым активируя их (Kobayasi et al., 2007). Мы предполагаем, что постоянная экспрессия гена rolC оказывает ингибирующие действие на работу НАДФН-оксидазы или кальциевой сигнальной системы. Ранее были изучены токи кальция в клетках культур R и RC-L под действием H2O2 (Шкрыль, 2006). Результаты этих экспериментов позволили предположить, что активность H2O2-индуцируемых кальциевых каналов в rolC-культуре марены значительно ингибирована относительно нетрансгенной культуры.

Изоформа StCDPK5 картофеля (Solanum tuberosum L.) активирует патогениндуцируемую НАДФН-оксидазу картофеля, что приводит к увеличению содержания АФК (Kobayasi et al., 2007). С помощью ПЦР с вырожденными праймерами мы идентифицировали форму CDPK марены, высокогомологичную (идентичность а. о. — 94%) форме StCDPK5 — RcCDPK3 (рис. 10). Анализ экспрессии гена RcCDPK3 в культурах R, RC-L и RC-H показал, что в rolC-клетках RC-L и RC-H экспрессия гена RcCDPK3 снижена относительно R культуры и составляет 74% и 36%, соответственно (рис. 11). Полученные данные указывают на ингибирующие влияние экспрессии гена rolC на кальциевую сигнальную систему, за счет которой осуществляется регуляция работы НАДФН-оксидаз.

Влияние гена rolC на экспрессию НАДФH-оксидазы в rolC-трансгенных культурах марены. НАДФH-оксидазы растений, гомологи НАДФН-оксидазы фагоцитов человека gp91phox (Groom et al, 1996), иначе называемые Rboh (respiratory burst oxidase homolog), генерируют АФК, вызывая тем самым окислительный взрыв (Doke, 1983; Keller et al., 1998; Torres et al., 1998; Amicucci et al., 1999; Yoshioka et al., 2001, 2003; Yoshie et al., 2005).

С помощью ПЦР с вырожденными праймерами были идентифицированы 3 формы Rboh марены: RcRboh1, RcRboh2 и RcRboh3. Основываясь на расположении этих форм Rboh марены в филогенетическом дереве, построенном на основе выравнивания а. о. Rboh арабидопсиса, табака и картофеля (рис. 12), мы предположили, что экспрессия гена RcRboh1 является патоген-индуруемой, а N-конец белка RcRboh1 содержит мотив для активирования посредством RcCDPK3. Экспрессия генов RcRboh2 и RcRboh3 является постоянной и активирование этих форм НАДФH-оксидаз посредством RcCDPK3 фосфорилирования маловероятно (Kobayasi et al., 2007).

Полуколичественный ОТ-ПЦР анализ показал, что в культурах RC-L и RC-H экспрессия гена RcRboh1 значительно снижена относительно R культуры и составляет 72% и 17%, соответственно. Экспрессия генов RcRboh2 и RcRboh3 в культурах R и RC-L значительно не различалась, в то время как в культуре RC-H эти конститутивные формы экспрессировались на крайне низком уровне (рис. 13).

.

Общая схема предполагаемого механизма rolC-индуцируемого ингибирования генерации активных форм кислорода. В данном исследовании было выявлено значительное снижение содержания АФК в rolC-клетках марены по сравнению с нетрансгенными, коррелирующее с уровнем экспрессии трансгена. При этом rolC-клетки генерируют гораздо меньше АФК в ответ на различные абиотические стрессы, что, повидимому, придает этим клеткам повышенную устойчивость. Чтобы объяснить этот феномен, было изучено влияние экспрессии гена rolC на систему регуляции окислительного взрыва.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»