WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

Веремейчик

Галина николаевна

ВЛИЯНИЕ АГРОБАКТЕРИАЛЬНЫХ ГЕНОВ ROLA, ROLB И ROLC НА УСТОЙЧИВОСТЬ К АБИОТИЧЕСКИМ ФАКТОРАМ И БИОСИНТЕЗ АНТРАХИНОНОВ В ТРАНСГЕННЫХ КУЛЬТУРАХ RUBIA CORDIFOLIA L.

03.00.23 — биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Владивосток 2008

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии Биолого-почвенного института ДВО РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук,

академик РАН,

Журавлев Юрий Николаевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор

Хотимченко Юрий Степанович

кандидат биологических наук, доцент

Кожемяко Валерий Борисович

Ведущая организация: Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Защита состоится «24» декабря 2008 г. в «12» часов на заседании диссертационного совета ДМ 005.003.04 при Биолого-почвенном институте ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159. факс: (4232) 310-193

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ДВО РАН.

Автореферат разослан «21» ноября 2008 г.

Ученый секретарь
диссертационного совета

кандидат биологических наук Музарок Т. И.

Общая характеристика работы

Актуальность темы.

Биотехнологическое производство биологически активных веществ связано с получением стабильных растительных штаммов-суперпродуцентов. В этой области биотехнология тесно связана с достижениями клеточной и генетической инженерии растений. Одним из перспективных направлений является исследование эффектов генов rol, участвующих в агробактериальной колонизации растений за счет горизонтального переноса генетического материала (Combard, Baucher, 1988; Hasen et al., 1991; Levesque et al., 1988). Экспрессия генов rol из Т-ДНК Agrobacterium rhizogenes в трансгенных растениях или клеточных культурах вызывает активацию вторичного метаболизма (Moyano et al., 1999). Расшифровка механизма этого процесса позволит использовать этот метод как поливалентный для получения штаммов-суперпродуцентов.

Поскольку вторичный метаболизм сопряжен со сложным механизмом защитных реакций растений, мы предполагаем, что совместная или индивидуальная экспрессия генов rolA, rolB и rolC способна в ряде случаев повысить устойчивость трансгенных клеток к негативным абиотическим факторам. Механизм rol-индуцируемой активации биосинтеза вторичных метаболитов в настоящее время активно изучается. Известно, что индивидуальная экспрессия генов rolB и rolC активирует биосинтез антрахинонов в культуре клеток марены сердцелистной (Rubia cordifolia L.) (Bulgakov et al., 2002), ценного лекарственного растения, экстракт которого используют для лечения почечнокаменной болезни и в качестве антиоксидантного и противомикробного препарата (Gilani et al., 1994, Pandey et al., 1994, Singh et al., 2004, Manojlovic et al., 2005). При этом изучение влияния экспрессии этих генов на устойчивость трансгенных клеток растений к абиотическим стрессам осталось в тени.

В данной работе мы впервые исследовали совместное влияние генов rolA, rolB и rolC на биосинтез антрахинонов и экспрессию гена изохоризматсинтазы (гена ключевого фермента биосинтеза антрахинонов) в трансгенных культурах марены. Кроме того, в рамках исследования совместного и индивидуального влияния генов rol на устойчивость трансгенных клеток марены к стрессам мы изучали содержание активных форм кислорода в этих клетках, поскольку известно, что устойчивость растений к стрессам напрямую связана с НАДФН-оксидазной сигнальной системой (Yahraus et al., 1995).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является выявление взаимосвязи между содержанием активных форм кислорода в клетках rol-трансгенных культур марены сердцелистной, их устойчивостью к неблагоприятным абиотическим факторам и активацией вторичного метаболизма при совместном и индивидуальном действии агробактериальных онкогенов.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

  1. Получить трансгенную культуру марены экспрессирующую совместно гены rolA, rolB и rolC — RABC,
  2. Изучить совместное и индивидуальное влияние агробактериальных генов rol на ростовые и биосинтетические характеристики трансгенных клеточных культур марены сердцелистной.
  3. Изучить совместное и индивидуальное влияние агробактериальных генов rol на содержание активных форм кислорода в клеточных культурах марены сердцелистной.
  4. Изучить реакцию трансгенных культур на воздействие негативными абиотическими факторами.
  5. Исследовать влияние экспрессии гена rolC на механизм регуляции окислительного взрыва.

Научная новизна. Впервые получена клеточная культура марены сердцелистной, экспрессирующая совместно гены rolA, rolB и rolC и изучено влияние генов rol на рост и биосинтез антрахинонов при их совместной экспрессии.

Впервые установлена положительная корреляция между экспрессией генов rolC и rolB и экспрессией гена ключевого фермента биосинтеза антрахинонов — изохоризматсинтазой при индивидуальной и совместной экспрессии этих трансгенов.

Впервые показано, что в клетках, экспрессирующих ген rolC, снижено содержание активных форм кислорода, что, по-видимому, повышает устойчивость rolC-культур к солевому и температурному стрессам. Показано, что в rolC-клетках снижен уровень экспрессии патогениндуцируемой изоформы гена НАДФН-оксидазы марены и значительно ингибирован регуляторный механизм этого фермента.

Практическая значимость. Установлено, что в культурах марены сердцелистной с высоким уровнем экспрессии гена rolC повышена устойчивость к абиотическим стрессам по сравнению с контрольной культурой: в 4 раза при солевом стрессе и при повышении температуры и в 6,2 раза при понижении температуры. Изучен возможный механизм, обеспечивающий rolC-опосредованное повышение устойчивости клеток.

Основные положения, выносимые на защиту.

  1. Повышение содержания антрахинонов и экспрессия гена изохоризматсинтазы в rolC- и rolB-трансгенных линиях марены сердцелистной обнаруживают положительную корреляцию с уровнем экспрессии трансгенов.
  2. Клеточные культуры марены, экспрессирующие ген rolC, обладают повышенной устойчивостью к неблагоприятным абиотическим факторам по сравнению с контрольной культурой.
  3. Эффекты экспрессии генов rolC (повышение устойчивости к стрессам) и rolB (активация биосинтеза антрахинонов) сохраняются и при их совместной экспрессии в культурах RABC и RA4, но друг друга не усиливают.
  4. С повышением уровня экспрессии гена rolC содержание активных форм кислорода в трансгенных клетках снижается, а устойчивость к неблагоприятным абиотическим факторам повышается. Возможно это связано с тем, что экспрессия гена rolC вызывает понижение экспрессии генов НАДФН-оксидаз марены, а так же оказывает ингибирующий эффект на систему регуляции патогениндуцируемой формы НАДФН-оксидазы.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на 10-ой Пущинской школе-конференции молодых учённых "Биология — наука 21 века" (Пущино, 2006), на Международном симпозиуме по биоразнообразию и биологически-активным веществам растений (Taiwan-Russia Bilateral Symposium on Plant Biodiversity and Bioactive Natural Products) (Тайвань, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы, из них 2 статьи в журналах из списка ВАК.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 111 страницах, иллюстрирована 29 рисунками и 4 таблицами. Список литературы содержит 168 наименований.

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии и группе биоинженерии Биолого-почвенного института ДВО РАН. Анализ содержания АФК в культурах марены выполнен совместно с Т. Ю. Горпенченко и Д. Л. Амининым, а анализ содержания СК в культурах марены выполнен совместно с П. С. Дмитренок в центре коллективного пользования ДВО РАН.

Благодарности. Автор выражает свою глубокую признательность научному руководителю академику Ю.Н. Журавлеву. Автор благодарит сотрудников группы биоинженерии В.П. Булгакова за ценные консультации по исследовательской работе, Ю.Н. Шкрыль за помощь в освоении методик молекулярной биологии. Автор искренне благодарит сотрудника группы биоинженерии Г.К. Чернодед за получение каллусных культур марены. Автор выражает благодарность сотрудникам ТИБОХ ДВО РАН Н.П. Мищенко, П. С. Дмитренок, Д. Л. Аминину и БПИ ДВО РАН Т. Ю. Горпенченко за помощь в проведении экспериментов.

Материалы и методы

В качестве объекта исследования использовали трансформированные генами rolA, rolB, rolC и диким штаммом Agrobacterium rhizogenes A4 каллусные культуры марены сердцелистной (Rubia cordifolia L.) — RA, RB-L, RB-M, RB-H, RC-L, RC-M, RC-H, RA4, соответственно. Нетрансформированная культура R использовалась в качестве контроля. Культуры были получены Г.К. Чернодед и В.П. Булгаковым методом агробактериальной трансформации (Bulgakov et al., 2002). Трансгенная каллусная культура, экспрессирущая гены rolA, B и C одновременно (RABC) была получена нами из листьев марены таким же способом. Культуры выращивали на питательной среде WB/A (Bulgakov et al., 1998), содержащей ростовые факторы 6-бензиламинопурин и -нафтилуксусную кислоту.

Для выделения РНК использовали метод, разработанный для растений с высоким содержанием вторичных метаболитов (Bekesiova et al., 1999). Обратную транскрипцию (ОТ) проводили с использованием набора фирмы Силекс (Москва, Россия), амплифицированную кДНК получали при помощи набора Mint фирмы Евроген (Москва, Россия). Определение концов кДНК проводили с помощью метода, основанного на явлении переключения матриц (template switching effect) и селективной супрессии полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Matz et al., 1999; Лукьянов и др., 1999), используя препараты амплифицированной кДНК марены.

Полуколичественный анализ экспрессии генов rol, кальцийзависимой протеинкиназы (RcCDPK3) и изохоризматсинтазы (RcICS1) проводили с использованием специфических праймеров, количественно измеряя продукты амплификации в экспоненциальной стадии ПЦР при помощи системы автоматизированного электрофореза "Experion" (Bio-Rad, США) с использованием технологии Lab-On-Chip (Gottwald et al., 2001). Уровень экспрессии изоформ гена НАДФН-оксидазы марены (RcRboh1, 2, 3) определяли методом подсчета клонов каждой изоформы гена, полученных при клонировании фрагментов Rboh, амплифицированных с вырожденными праймерами 5’-TTY TAY TGG GTN ACN MGN GAR-3' и 5’-RAA RTK YTC YTT RTG RAA-3', в вектор pTZ57R/T (Fermentas, Vilnius, Lithuania). Экспрессию всех генов нормализовали по уровню экспрессии гена актина марены (RcAct, код доступа в GeneBank DQ531565). Все продукты ПЦР были секвенированы с праймерами M13 (Fermentas, Vilnius, Lithuania) при помощи набора Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Perking-Elmer Biosystems, Forster City, CA) согласно рекомендации фирмы-производителя. После осаждения этанолом последовательность была определена на секвенаторе ABI 310 Genetic Analyser (Applied Biosystems).

Поиск гомологов секвенированных фрагментов кДНК осуществляли в базе данных последовательностей GenBank в программе BLAST (Altschul et al., 1990). Аминокислотные последовательности, соответствующие секвенированным фрагментам кДНК, определяли в программе Gene Runner 3.0. Сравнение секвенированных участков генов марены с соответствующими генами из других видов растений проводили в программе ClustalX 1.81, филогенетические деревья строили на основе произведенных сравнений в программе TreeView 1.6.6 (Feng, Doolittle, 1987).

Определение содержания антрахинонов проводили спектрофотометрическим методом (Mischenko et al., 1999).

Измерение внутриклеточной концентрации активных форм кислорода (АФК) проводили при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM 510 meta (Carl Zeiss, Germany), оснащенном аргоновым лазером, мощностью 30 мВт с использованием флуоресцентных красителей: 50 мкМ 2,7-дихлорфлуоресцеин диацетат (H2DCF-DA, Molecular Probes, Eugene, OR), 10 мкМ дигидрородамин 123 (H2R123, Molecular Probes).

Результаты и обсуждение

Индивидуальное и совместное действие генов rol в трансгенных культурах марены сердцелистной

Характеристика клеточных культур, трансформированных генами rolA, rolABC и диким штаммом A4. Нетрансгенная культура R, имеет вид рыхлой желтой ткани, в то время как трансформированные культуры RA, RABC и RA4 имеют более насыщенную окраску. Все культуры обладают стабильным ростом и минимальной изменчивостью по накоплению биомассы в течение длительного выращивания.

Доказательство трансгенности RA, RABC и RA4 культур марены сердцелистной. Для доказательства встройки генов rol в культурах RA, RABC и RA4 проводили ПЦР со специфическими праймерами к генам rolA, rolC и rolB на препаратах ДНК, выделенных из всех трех культур одного срока культивирования (рис. 1). В ДНК, выделенной из контрольной культуры, нет последовательностей гомологичных праймерам. Культура RA содержит только ген rolA, а культуры RABC и RA4 содержат все три гена rol.

Доказательство экспрессии генов rol в rolA-, rolABC- и A4- культурах марены. Для детекции экспрессии генов rol в трансгенных культурах использовали кДНК культур марены R, RA, RABC и RA4. В результате ПЦР со специфическими праймерами к генам rolA, B и С (рис. 2) на кДНК культур R, RA, RABC и RA4 были получены сигналы, которые показали наличие экспрессии генов rol в трансгенных культурах.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»