WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |

В условиях длительного применения препарат из сухой биомассы клеток E. sericeum в дозе 100 мг/кг/день оказал выраженное воздействие на функцию почек экспериментальных животных, что выражалось в достоверном увеличении показателей диуреза, а так же натрийуретической и калийуретической реакции (табл.5). Тем не менее, прирост экскреции электролитов значительно уступал по степени выраженности диуретическому действию: двукратное возрастание суточного диуреза сопровождалось менее выраженным натрийурезом (+45%) и калийурезом (+48%). Возрастание диуреза, сопровождающееся уменьшением реабсорбции электролитов, на фоне увеличения экскреции креатинина (до 59% по сравнению с контролем) позволяет связать мочегонное действие препарата незабудочника шелковистого с усилением скорости клубочковой фильтрации и угнетением канальцевой реабсорбции при доминировании последнего, о чем свидетельствует более существенный рост диуретической реакции.

Таблица 5. Влияние длительного введения препарата из биомассы клеток E. sericeum на функцию почек у крыс

Показатель,

сутки

Контроль

Дни введения препарата

Через

2 дня1

3

5

7

9

11

13

Диурез,

мл/сутки

7.4±0.5

10.1

±1.3

12

± 1.3*

13.1

±1.49*

15.1

±1.6*

13.8

±1.3*

14.6

±1.6*

13.5

±1.2*

Экскреция

Na+, мкМ/сутки

56±4.0

56

±10.8

73

± 10

77

±9.8

81

±6.2*

71

±6.2

71

±5.2*

75

±5*

Экскреция

K+,

мкМ/сутки

640±35.8

763

±67.3

722

±76.5

755

±77

898

±81.6*

929

±101.2*

950

±85.6*

900

±81.4*

Экскреция

креатинина

мкМ/сутки

42 ±4.2

45

± 5.8

51

±6.1

64

±63*

65

±5.7*

63

± 5*

67

±7.1*

60

±5.2*

1 после окончания эксперимента

* р < 0.05

Влияние метаболитов кофейной кислоты из клеточной культуры E. sericeum на течение экспериментального острого воспаления

Применение препарата из сухой биомассы клеток E. sericeum (линия Е-4) ослабляло формирование воспалительного отека лапы крыс после введения флогистика (табл. 6).

Таблица 6. Влияние препарата из биомассы клеток E. sericeum на развитие каррагенинового отека конечностей крыс

Группы животных

Часы наблюдения

1

2

4

Прирост отека,

см3

Противовос-палительная активность, %

Прирост отека,

см3

Противовос-палительная активность, %

Прирост отека,

см3

Противовос-

палительная

активность, %

I

0.49±0.04

0.55±0.04

0.67±0.05

II

0.35±0.03

28.6

0.35±0.04

36.4

0.50±0.05

25.3

I крысы с индуцированным воспалительным отеком, которые не получали препарат из сухой биомассы E. sericeum, II крысы с индуцированным воспалительным отеком, которые получали данный препарат

Учитывая эффективность препарата из биомассы Е-4 в период энергичного нарастания отека, его действие, по-видимому, обусловлено вмешательством в пусковые механизмы воспалительного процесса с угнетением сосудистого компонента воспаления. Антиэкссудативное действие препарата из биомассы E. sericeum можно связать с содержанием в ткани комплекса полифенольных соединений, представленных олигомерами кофейной кислоты, противовоспалительное действие которых реализуется за счет стабилизации мембран клеток (Барабой, 1984).

Влияние клеточной культуры E. sericeum на процессы свободно-радикального окисления

Изученные in vitro спиртовые извлечения (50% и 70% экстракты) из клеточной культуры незабудочника шелковистого оказывали существенное воздействие на активность свободно-радикального окисления, влияя на состояние как антиоксидантной, так и прооксидантной систем.

Эксперименты in vivo проводили на модели острой экспериментальной ишемии одной почки, что позволяет оценить активность оксидантной и антиоксидантной систем в почечной ткани в условиях кратковременной ишемии. Было выявлено, что общая прооксидантная активность в ишемизированной почке по сравнению с интактной увеличилась у контрольных животных в 1.2 раза, у принимавших препарат – в 1.4 раза. Таким образом, применение препарата из биомассы клеток незабудочника шелковистого вызвало активацию перекисного окисления липидов в ишемизированной почке (p<0.001). Ишемия почки индуцировала резкую активизацию перекисного окисления липидов, что выразилось в увеличении образования тиобарбитуровых продуктов более чем в 3 раза как в контрольной группе, так и в группе животных, длительно принимавших препарат. При определении антиоксидантного статуса была зафиксирована активация процесса антиоксидантной защиты в почке, подвергнутой ишемии, что объясняется увеличением образования продуктов свободно-радикального окисления в ишемизированной почке. При длительном препарата введении была обнаружена способность стимулировать активность свободно-радикального окисления в условиях непродолжительной ишемии почки. Это, в свою очередь, обусловливало активацию ферментов антиоксидантной защиты, что выражалось в увеличении содержания каталазы, глутатионпероксидазы, а также интегративного показателя общей антиоксидантной активности.

Таким образом, обнаруженные в эксперименте усиление экскреторной функции почек и угнетение экссудативной стадии воспаления под действием препарата из клеточной культуры Eritrichium sericeum, а также данные об эффективности препарата при нефрите Масуги (Inyushkina et al., 2007), делают препарат перспективным для применения при воспалительных заболеваниях почек.

Полученные результаты позволяют считать углубленное изучение фармакологической активности препарата, полученного из культуры клеток незабудочника шелковистого (линия Е-4) перспективным. Возможное использование каллусной культуры E. sericeum в медицине – это разработка препаратов для лечения заболеваний почек и препаратов, связанных с антиоксидантным действием, например, для лечения ревматоидных артритов и создания антиаллергических средств.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ранее в нашей лаборатории были получены клеточные культуры таких растений, как Lithospermum erythrorhizon, Rubia cordifolia, Panax ginseng, Vitis amurensis (Rupr.), Maackia amurensis (Rupr. et Maxim.), стабильно синтезирующие вторичные метаболиты. Особенностью работы с культурами E. sericeum явилось то, что при кажущейся простоте получения высокопродуктивной гомогенной культуры, эта задача выполнялась с трудом и на протяжении ряда лет. Действительно, первичные каллусы были чрезвычайно гетерогенны, мы наблюдали расщепление ткани на агрегаты различные по морфологии, скорости роста и содержанию вторичных метаболитов в течение не отдельных пассажей (как происходит обычно), а многих лет. Этот факт заставлял задумываться о том, можно ли вообще использовать в биотехнологии этот вид растения.

Другое обстоятельство и необычность объекта исследования заключались в том, что клетки незабудочника шелковистого ответили парадоксальным образом на введение гена rolC – признанного активатора вторичного метаболизма. Долговременное подавление продуктивности в rolC-трансгенных культурах незабудочника шелковистого наводило на мысль о то, что ген rolC не является классическим активатором вторичного метаболизма (как другие гены, используемые в настоящее время в биотехнологии), а скорее это модулятор, реализующий свой потенциал в зависимости от регуляторного и биохимического контекста клетки каждого отдельно взятого вида растений. Представлялось, что исследование механизма действия гена в разных модельных системах – в случае явного стимулирования и в случае явного ингибирования процессов вторичного метаболизма, может пролить свет на механизм его действия.

Подытожим, как эти задачи решались в процессе настоящего исследования. Решению первой – созданию высокопродуктивного штамма клеток, помогло то обстоятельство, что метаболиты кофейной кислоты – это группа постоянно экспрессируемых вторичных метаболитов ("preformed secondary metabolites"), которые находятся под жестким регуляторным контролем растительной клетки. Это означает практически гарантированную стабильность биосинтеза вторичных метаболитов в том случае, если бы удалось отобрать стабильные активно-растущие агрегаты. Эта задача была выполнена путем долговременной селекции. Но это же свойство биосинтетического аппарата незабудочника шелковистого означало и то, что будет очень трудно влиять на синтез вторичных метаболитов путем стандартных воздействий элиситорами, что и оказалось в действительности. Только два элиситора – метилжасмонат и ионы меди могли каким-то образом повлиять на увеличение продуктивности культуры. В итоге получена линия Е-4, которая показала обнадеживающие фармакологические результаты.

В плане исследования регуляторной функции гена rolC получено два принципиальных результата. Первый заключается в том, что ген оказывает влияние на экспрессию отдельных форм ключевых генов биосинтеза вторичных метаболитов. В этом плане обстоятельства складывались удачно – уже был известен ключевой ген в цепочке биосинтеза розмариновой кислоты, CYP98A6. Идентификация аналога этого гена у незабудочника шелковистого (CYP98A3) и изучение его экспрессии показали уникальную картину увеличения экспрессии отдельного гена в rolC-культуре, сопровождаемую увеличенным накоплением полифенолов. Эти данные хорошо согласуются с данными, полученными на других объектах. Так, в культурах клеток марены, rolC активировал экспрессию гена изохоризматсинтазы, ключевого в биосинтезе антрахинонов (Shkryl et al., 2008). На модели трансгенных клеток марены не удалось выявить какую-либо специфичность действия гена, так как гены изохоризматсинтазы были представлены лишь двумя высоко гомологичными формами.

Второй результат – это выявление медленнотекущих процессов в rolC-трансгенных культурах. Первоначально экспрессия гена rolC в культуре трансгенных клеток растений семейства бурачниковые (E. sericeum, L. erythrorhizon) привела к супрессии вторичного метаболизма. Далее, при продолжительном культивировании, rolC-трансгенные каллусы E. sericeum стали аккумулировать значительные количества метаболитов кофейной кислоты. Следует отметить, что сходный эффект наблюдался также для культур клеток женьшеня, трансформированных геном rolC (Булгаков и др., 1993), однако в то время его посчитали случайностью. Для женьшеня период уменьшенной (по сравнению с контролем) продукционной способности трансгенных каллусов составлял 6 мес., затем наблюдали быстрое увеличение содержания гинзенозидов в rolC-культурах женьшеня и превышение их уровня над контрольной культурой стабилизировалось. Аналогичная ситуация наблюдалась и для других эффектов гена rolC, например, образования трансгенных корней и апикальных меристем rolC-каллусами женьшеня (Gorpenchenko et al., 2006). Эти долговременные процессы требуют отдельного изучения.

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»