WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |

0

7.38 ± 0.32

1.07

4.63

5.70

813

0.5

7.33 ± 0.28

1.37

4.53

5.90 (104)

838

1

7.24 ± 0.19

1.47

5.39

6.86 (120)

960

5

5.39 ± 0.48

2.56

5.30

7.86 (138)

825

CuSO4, мг/л

0.025б

7.67 ± 0.48

2.50

3.50

6.00

894

0.25в

7.02 ± 0.28

4.11

2.30

6.41 (107)

871

а В скобках приведено содержание полифенолов в процентах от контроля (без добавления элиситора), б CuSO4 х 5 Н2О, стандартная концентрация для среды WБ/А; в CuSO4 х 5 Н2О использовался в виде глицерата меди. Для определения содержания полифенолов использовали среднюю пробу из 10 колб

Добавление ионов меди в составе Cu2+-глицератного комплекса в культуральную среду в сравнительно высокой концентрации – 0.25 мг/л не повлияло на общее содержание полифенолов, но изменило соотношение рабдозин/розмариновая кислота в сторону увеличения содержания более активного вещества рабдозина. Таким образом, содержание (–)-рабдозина в каллусах незабудочника повысилось до 4.1% от сухого веса ткани (табл. 3). По нашим данным, это самое высокое содержание рабдозина, известное для природных и биотехнологических источников.

В работе Ямамото и соавторов приведено максимальное содержание (+)-рабдозина, которое было зафиксировано в суспензионной культуре клеток L. erythrorhizon (1.4% от сухой массы клеток, Yamamoto et al., 2000a). Ранее было сделано предположение, что продукция розмариновой кислоты и рабдозина в клетках растений семейства бурачниковые регулируется различными механизмами (Fedoreyev et al., 2005). По-видимому, метилжасмонат активирует пути биосинтеза как рабдозина, так и розмариновой кислоты, в то время как ионы Cu+2 активируют превращение розмариновой кислоты в рабдозин.

Изменение содержания метаболитов кофейной кислоты при длительном культивировании каллусов

При длительном культивировании проводился постоянный контроль за содержанием полифенолов в пассируемой ткани. Так, методом ВЭЖХ было зафиксировано изменение содержания метаболитов кофейной кислоты в каллусных культурах E. sericeum: на период 2006-2008 гг. отмечено повышение содержания полифенолов в rolC-трансгенной культуре каллусов по сравнению с контрольной культурой Es-vector (табл. 4).

Таблица 4. Содержание метаболитов кофейной кислоты в контрольной и rolC-трансгенной культурах клеток E. sericeum на период 2006-2008 гг.

Культура клеток

Сырая биомасса, г/л

Сухая биомасса, г/л

% сухой биомассы

Содержание метаболитов кофейной кислоты, % от сухой биомассы

Продук-ция полифе-нолов, мг/л

Рабдозин

Розмарино-вая кислота

Сумма полифено-лов

Es-vector

492 ± 3.3

14± 0.8

2.9

1.6 ± 0.2

1.1 ± 0.2

2.7

385

Es-rolC

283 ±53.6

12.9 ±1.1

4.6

2.0 ± 0.7

3.0 ± 0.7

5.0

649

Данные получены по результатам шести экспериментов, с интервалом в три месяца

Увеличение содержания полифенолов в rolC-трансгенной культуре каллусов сопровождалось, однако, уменьшением сырой массы клеток. Продуктивность сухой биомассы в Es-rolC культуре практически не уменьшилась, но снижение сырой массы делает rolC-трансгенную культуру менее удобной для промышленного использования. Это вызвано тем, что снижение показателей продуктивности сырой биомассы требует значительную часть материала направлять на поддержание культуры, а не на съем биомассы. Таким образом, можно заключить, что каллусы Es-rolC в плане промышленного производства в настоящее время не имеет преимуществ над каллусами линии Е-4.

Дифференциальная активация транскрипции специфических изоформ генов вторичного метаболизма под действием гена rolC

Для изучения возможного механизма активации биосинтеза метаболитов кофейной кислоты, опосредуемого продуктом экспрессии гена rolC, мы исследовали экспрессию ключевых генов биосинтеза фенилпропаноидного пути вторичного метаболизма: фенилаланин аммиак-лиазы (PAL) и цитохром-Р450-монооксигеназы (CYP) в культурах каллусов незабудочника шелковистого Es-vector и Es-rolC.

Экспрессия генов PAL

Фенилаланин аммиак-лиаза (PAL) является первым и ключевым ферментом фенилпропаноидного пути вторичного метаболизма растений. Активность генов PAL определяет интенсивность потока метаболитов в фенилпропаноидный путь. Используя метод ОТ-ПЦР с вырожденными праймерами, мы получили ампликоны ожидаемого размера (266 п.н.) для культур Es-vector и Es-rolC (рис. 4а). Оценка суммарной экспрессии генов PAL показала, что экспрессия не отличается в контрольной и rolC-трансгенной культурах (рис. 4б).

а Гель-электрофорез продуктов ОТ-ПЦР генов PAL E. sericeum. 1, 2 препарат кДНК из каллусной культуры Es-vector, разведения матрицы кДНК 1:3 и 1:1, соответственно; 3, 4 препарат кДНК из каллусной культуры Es-rolC, разведения матрицы кДНК 1:3 и 1:1, соответственно; М маркер молекулярной массы; НК негативный контроль (реакционная смесь без анализируемой кДНК); б количественная оценка суммарной экспрессии гена PAL, данные представлены в относительных единицах и нормированы относительно экспрессии гена актина E. sericeum

Клонирование и секвенирование ампликонов, полученных с использованием препаратов кДНК из каллусных культур Es-vector и Es-rolC, показало гомологию секвенированных транскриптов с известными генами PAL растений. Анализ клонов выявил, что в обеих культурах экспрессируется только одна форма гена – PAL1 (код доступа EU494974). В результате клонирования и секвенирования ампликонов, полученных с использованием препаратов ДНК обеих культур, было выявлено ещё две формы гена, PAL2 и PAL3.

Таким образом, результаты изучения экспрессии генов PAL в контрольной и rolC-трансгенной культурах E. sericeum соответствуют полученным ранее данным об отсутствии в каллусах незабудочника ограничения потока метаболитов со стороны реакции, катализируемой PAL, поскольку добавление фенилаланина не вызвало активацию биосинтеза метаболитов кофейной кислоты (Inyushkina et al., 2007).

Экспрессия генов CYP

Аналогично анализировали экспрессию генов CYP и установили, что значения суммарной экспрессии генов CYP находились в пределах ошибки и были одинаковы для культур Es-vector и Es-rolC (рис. 5 а, б).

а Гель-электрофорез продуктов ОТ-ПЦР генов CYP. 1, 2 препарат кДНК из каллусной культуры Es-vector, разведения матрицы кДНК 1:3 и 1:1, соответственно; 3, 4 препарат кДНК из каллусной культуры Es-rolC, разведения матрицы кДНК 1:3 и 1:1, соответственно; М маркер молекулярной массы; НК негативный контроль (реакционная смесь без анализируемой кДНК); б количественная оценка суммарной экспрессии генов CYP, данные представлены в относительных единицах и нормированы относительно экспрессии гена актина E. sericeum

Анализ полученных фрагментов CYP из E. sericeum показал, что все они по аминокислотным последовательностям наиболее близки к известным цитохром P-450-содержащим монооксигеназам растений семейства CYP98 (рис. 6), которые кодируют 3'-гидроксилазы эфиров кумаровой кислоты и вовлечены в биосинтез вторичных метаболитов.

Аминокислотные последовательности, построенные на основе секвенированных транскриптов CYP98 незабудочника шелковистого, представляли собой междоменную область размером 74 аминокислотных остатка.

Рис. 6. Филогенетическое дерево белков семейства CYP, построенное с помощью программы ClustalX по аминокислотным последовательностям CYP из E. sericeum и последовательностям известных представителей P450 других видов растений. В скобках указаны функции соответствующих белков. В рамку выделены CYP из E. sericeum

В результате секвенирования и последующего выравнивания в программе ClustalX из незабудочника шелковистого нами было идентифицировано 3 гена: CYP98A1, CYP98A2 и CYP98A3 (коды доступа в GenBank: EU494971, EU494972, EU494973). Идентичность между ними по аминокислотной последовательности составляла не менее 71%. Выравнивание и сравнение аминокислотных последовательностей фрагментов CYP98 E. sericeum с известными последовательностями цитохром P450-зависимых монооксигеназ растений показало, что CYP98A1 E. sericeum на 80% гомологичен CYP98A2 (код доступа O48922) из сои Glycine max (L.), ферменту с неизвестной субстратной специфичностью (Siminszky et al., 1999). CYP98А2 E. sericeum наиболее близок к CYP98A13 (код доступа AAL99200) из базилика Ocimum basilicum (L.) (94% гомологии), который кодирует 3'-гидроксилазу шикимового эфира п-кумаровой кислоты (Gang et al., 2002). CYP98A3 E. sericeum на 94% гомологичен CYP98A6 (код доступа BAC44836) из культуры клеток воробейника L. erythrorhizon (Matsuno et al., 2002) (рис. 7). CYP98A6 является гидроксилазой 4-кумароил-4'-гидроксифенилмолочной кислоты, т.е. ферментом, который катализирует последние стадии биосинтеза розмариновой кислоты.

Анализ экспрессии CYP98A3 показал, что количество транскриптов CYP98A3 в Es-rolC каллусах было примерно в 5 раз выше, чем в контрольной культуре Es-vector (рис. 8). При этом уровень экспрессии CYP98А2 не изменился, а CYP98A1 уменьшился примерно в два раза. Данные ПЦР в реальном времени с праймерами, подобранными к CYP98A3, показали увеличение экспрессии CYP98A3 в Es-rolC каллусной культуре в 3.6 раза по сравнению с контрольной культурой Es-vector. Эти данные свидетельствуют о том, что ген rolC осуществляет дифференциальную регуляцию специфического гена CYP, а активация экспрессии CYP98A3 в rolC-трансгенной культуре незабудочника шелковистого по сравнению с контролем коррелирует с активацией продукции полифенолов. Наши данные соответствуют результатам, полученным японскими учеными, которые при стимуляции культуры клеток L. erythrorhizon элиситорами наблюдали значительное увеличение как продукции розмариновой кислоты, так и экспрессии гена CYP98A6 (Matsuno et al., 2002).

Рис. 7. Выравнивание аминокислотных последовательностей CYP98A1, CYP98A2 и CYP98A3 из каллусных культур E. sericeum с аминокислотными последовательностями представителей семейства CYP98: CYP98А13 (AAL99200) – Ocimum basilicum, CYP98A2p (O48922) – Glycine max, CYP98A6 (BAC44836) – Lithospermum erythrorhizon, CYP98A8 (NP_177594) – Arabodopsis thaliana

Es – E. sericeum, Le – L. erythrorhizon, At – A. thaliana, Ob – O. basilicum, Gm – G. maх

Рис. 8. Нормализованная экспрессия подсемейств генов CYP в контрольной (Es-vector) и rolC-трансгенной (Es-rolC) каллусных культурах E. sericeum

Значения уровня экспрессии каждого гена, выраженные в относительных единицах, получали на основе данных относительной общей экспрессии генов CYP и количественного распределения секвенированных клонов в культурах Es-vector и Es-rolC

Фармакологические свойства клеточной биомассы E. sericeum и возможность её применения в медицине

Влияние препаратов из клеточной культуры E. sericeum на функцию почек у крыс

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»