WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

Эксперименты по выявлению фармакологического действия препаратов из культуры клеток E. sericeum проводили на беспородных крысах. Измеряли суточный диурез, суточную экскрецию креатинина, ионов калия и натрия. Препарат из сухой измельченной биомассы E. sericeum (линия E-4) в виде 2%-ной крахмальной взвеси вводили крысам при помощи желудочной помпы в дозе 100 мг/кг в день, что соответствовало 4.5 мг розмариновой кислоты и 1.5 мг рабдозина. Противовоспалительную активность препарата изучали на модели острого воспалительного отека лапы крысы, вызванного каррагенином. Для исследования возможной прооксидантной и антиоксидантной активности in vitro использовали спиртовые 50% и 70% экстракты полифенолов E. sericeum. Содержание продуктов окисления ТВИН-80 определяли спектрофотометрическим методом. В экспериментах in vivo исследовали влияние препаратов из сухой биомассы E. sericeum на состояние свободно-радикального окисления в почке крыс в обычных условиях и на фоне непродолжительной ишемии. Общую прооксидантную активность, суммарный показатель концентрации всех прооксидантов и свободно-радикальных метаболитов оценивали по накоплению в почечной ткани продуктов перекисного окисления липидов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой. Антиоксидантную активность оценивали по изменению интегративного показателя общей антиоксидантной активности и активности антиоксидантных ферментов (каталазы, глутатионпероксидазы, супероксиддисмутазы).

Данные были обработаны при помощи программы Statistica, версия 5.5. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка и проверены по критерию Стьюдента. Уровень значимости в 0.05 выбран как минимальное значение статистической разницы во всех экспериментах.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Клеточные культуры

Характеристика клеточных культур E. sericeum

Первичные каллусы Es-vector (из которых нами в дальнейшем получена линия Е-4) и Es-rolС были получены в 2003 году из проростков семян E. sericeum методом агробактериальной трансформации (Bulgakov et al., 2005). В итоге селекции с использованием канамицина были получены культуры корней и каллусов Es-vector и Es-rolC (рис. 2а,б).

Рис. 2. Культуры каллусов (а) и корней (б) E. sericeum

Ко времени начала настоящей работы, контрольная каллусная культура Es-vector характеризовалась активным ростом и представляла собой рыхлую каллусную ткань коричнево-серого цвета. Продуктивность сырой биомассы составляла в среднем 491 ± 43 г/л. RolC-трансгенная культура Es-rolC характеризовалась замедленным ростом по сравнению с культурой Es-vector и представляла собой более рыхлую, обводненную каллусную ткань коричнево-желтого цвета, со средней продуктивностью биомассы 283 ± 53 г/л. В течение нескольких лет rolC-трансгенная ткань была гетерогенной, проявляла нестабильность фенотипических и ростовых характеристик. Полученные культуры корней имели необычную темно-коричневую (Es-vector) и коричневую (Es-rolC) окраску. RolC-трансгенные корни характеризовались более активным ростом по сравнению с контрольной культурой. Так, продуктивность сырой биомассы корней Es-vector и Es-rolC составлял 169 ± 19 г/л и 211 ± 17 г/л, соответственно.

Трансгенность этих культур была доказана при помощи метода ПЦР-анализа со специфическими праймерами к гену nptII. Для подтверждения нативности кДНК и ДНК мы проверяли их на наличие сигнала к гену актина. Ампликоны, полученные с использованием препаратов ДНК, имели размер 290 п.н., кДНК 206 п.н., а выпавший фрагмент представлял интрон (рис. 3а). Подобранные таким образом праймеры позволяют убедиться в отсутствии примеси ДНК в препаратах кДНК. Экспрессия гена rolC в культуре корней Es-rolС была показана методом ОТ-ПЦР, где наличие соответствующего сигнала размером 394 п.н. указывает на то, что ген rolC успешно экспрессируется. Этот сигнал в контрольной культуре Es-vector отсутствовал (рис. 3б). Для определения экспрессии гена rolC в каллусной культуре E. sericeum был использован метод ПЦР в реальном времени.

а ПЦР гена актина E. sericeum, б ПЦР гена rolC; М маркер молекулярных весов, 1 препараты кДНК из культур Es-rolC, 2 препараты кДНК из культур Es-vector, НК негативный контроль (реакционная смесь без анализируемой кДНК), ПК позитивный контроль (плазмида PCV002-rolABC)

Химический анализ полифенольных фракций из клеточных культур E. sericeum показал, что доминирующими веществами, накапливаемыми в культурах корней и каллусов, являлись метаболиты кофейной кислоты, а именно розмариновая кислота и (–)-рабдозин (табл. 1). Кроме того, в культурах было обнаружено небольшое количество тримера кофейной кислоты, эритрихина (Fedoreyev et al., 2005). В дальнейшем мы его не учитывали, поскольку эритрихин не вносит заметного вклада в суммарную продуктивность культур.

Таблица 1. Рост и биосинтетическая активность культур корней и каллусов E. sericeum

Содержание метаболитов кофейной кислоты,

% от сухой биомассы

Продукция метаболитов кофейной кислоты

(мг/л)

Образец

ткани

Рабдозин

Розмариновая кислота

Общее содержание

полифенолов

Каллусы

Es-vector

0.90 ± 0.35

2.32 ± 1.30

3.22 ± 1.22

409

Каллусы

Es-rolC

0.59 ± 0.32

0.81 ± 0.48*

1.40 ± 0.40*

181

Культура корней

Es-vector

1.66 ± 0.10

4.56 ± 0.50

6.22 ± 0.43

746

Культура корней

Es-rolC

0.84 ± 0.07*

2.00 ± 0.30*

2.84 ± 0.25*

415

Надземные части растения

0.01 ± 0.007

следовое количество

0.01 ± 0.007

Корни природного растения

0.32 ± 0.12

0.07 ± 0.02

0.39 ± 0.12

Данные получены на основе десяти определений содержания метаболитов кофейной кислоты в культурах клеток за период 2-х летнего культивирования (2004-2005 гг), * р < 0.05

ВЭЖХ-анализ показал, что клеточные и корневые культуры по содержанию метаболитов кофейной кислоты существенно превосходят природное растение. На период 2004-2005 годов наблюдалось снижение содержания полифенолов в rolC-трансформированных культурах каллусов и корней (Es-rolC) незабудочника шелковистого – более чем в 2 раза по сравнению с контрольными культурами Es-vector.

Культура корней незабудочника шелковистого накапливала больше полифенолов, чем каллусная, однако, исходя из технологических особенностей культивирования (каллусы имеют ряд преимуществ при промышленном культивировании), главной задачей являлось увеличение продуктивности именно каллусной культуры.

Получение высокопродуктивной клеточной культуры E. sericeum

Известно, что трансформация "пустым" вектором является нейтральной в плане влияния на синтез вторичных метаболитов и рост клеток. Принимая во внимание то, что изначально каллусная культура Es-vector обладала более высокими ростовыми и биосинтетическими показателями по сравнению с rolC-трансгенной культурой Es-rolC, было решено использовать именно ее для получения высокопродуктивной клеточной линии и для исследования фармакологических свойств. Первичный каллус Es-vector состоял из светло-желтых, светло-коричневых и темно-коричневых агрегатов, отличавшихся по интенсивности роста и содержанию полифенолов. Методом селекции более чем через 20 циклов субкультивирований были получены активно-растущие гомогенные каллусы, обозначенные линией E-4. Общее содержание метаболитов кофейной кислоты в селектируемой ткани Е-4 было повышено с 2.7% до 6.3% от сухого веса биомассы и оставалось стабильным на протяжении более двух лет культивирования (табл. 2). Такой выход вторичных метаболитов значительно превышал содержание полифенолов в надземных частях и корнях природного растения: в 635 и 16 раз, соответственно.

Таблица 2. Получение высокопродуктивной каллусной линии E-4 из исходной культуры Es-vector

Образец

ткани

Сырая биомасса, г/л

Сухая биомасса,

г/л

Содержание метаболитов кофейной кислоты,

% от сухой биомассы

Продукция

метаболи- тов кофейной кислоты, мг/л

(–)-Рабдозин

Розмарино- вая

кислота

Сумма

полифе-нолов

Первичный каллус

90 ± 11

7.2 ± 0.6

0.62 ± 0.05

0.84 ± 0.22

1.45

104

Es-vector,

10й пассаж

165 ± 23

8.9 ± 0.7

0.33 ± 0.05

1.02 ± 0.12

1.35

120

Es-vector,

20й пассаж

180 ± 30

9.2 ± 1.0

0.66 ± 0.22

2.04 ± 0.40

2.70

249

Es-vector,

30й пассаж

310 ± 28

14.1 ± 1.2

1.83 ± 0.32

4.32 ± 0.33

6.15

867

Es-vector,

40й пассаж

311 ± 21

14.5 ± 1.1

1.80 ± 0.26

4.55 ± 0.45

6.35

920

Начальная масса ткани при пассировании: 16-20 г/л

Влияние метилжасмоната и глицерата меди на продукцию метаболитов кофейной кислоты в культуре клеток E. sericeum

С целью дальнейшего увеличения продуктивности линии Е-4 мы использовали другие стандартные биотехнологические методы варьировали концентрацией сахарозы в культуральной среде, изменяли соотношение ионов аммоний и нитратов в среде, добавляли фенилаланин предшественник биосинтеза метаболитов кофейной кислоты, использовали пироксикам (индуктор шикимат-производного пути вторичного метаболизма). Все эти приемы оказались не эффективными либо подавляли рост каллусов. Поэтому дальнейшее повышение содержания полифенолов в каллусной культуре незабудочника шелковистого оказалось сложной задачей. Тем не менее, были обнаружены два индуктора, повлиявшие на биосинтез полифенолов в каллусах: метилжасмонат и ионы Cu2+. Метилжасмонат является известным активатором вторичного метаболизма растений. При исследовании влияния метилжасмоната на каллусную культуру Е-4 было обнаружено, что метилжасмонат в концентрациях 1 и 5 мкМ стимулировал продукцию как розмариновой кислоты, так и рабдозина при некотором угнетении роста. В этом случае содержание розмариновой кислоты увеличилось в 1.2 раза, продукция (–)-рабдозина – в 2.4 раза, общее содержание полифенолов в клетках повысилось на 20-38% по сравнению с контролем (табл. 3).

Таблица 3. Влияние метилжасмоната и Cu2+ на рост каллусов Е-4 и содержание в них метаболитов кофейной кислоты

Элиситор/ концентрация

Сырая биомасса, г

Содержание метаболитов кофейной кислоты, % от сухого веса ткани

Продукция метаболи-тов кофейной кислоты, мг/л

(–)-Рабдозин

Розмари-новая кислота

Сумма полифе-нолов (% от контроля)а

Метилжасмонат, мкМ

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»