WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |

На правах рукописи

Инюшкина

Юлия Витальевна

Продукция метаболитов кофейной кислоты в ОБЫЧНЫХ и трансформированных геном rolC Культурах клеток

Eritrichium sericeum (Lehm. CD.)

03.00.23 – биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Владивосток – 2008

Работа выполнена в группе биоинженерии Биолого-почвенного института ДВО РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук,

член-корреспондент РАН

Булгаков Виктор Павлович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор

Кушнерова Наталья Федоровна

кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник

Аминин Дмитрий Львович

Ведущая организация: Тихоокеанский институт биоорганической химии

ДВО РАН, г. Владивосток

Защита состоится « 24 » декабря 2008 года в « 10 » часов на заседании диссертационного совета ДМ 005.003.04 при Биолого-почвенном институте ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159.

факс: (4232) 310-193

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ДВО РАН.

Автореферат разослан « » ноября 2008 года

Ученый секретарь
диссертационного совета,

кандидат биологических наук Музарок Т. И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Одним из перспективных направлений биотехнологии растительной клетки является получение вторичных метаболитов для фармацевтической промышленности. Этот подход основан на том, что клеточные культуры растений сохраняют свойство целого растения синтезировать и накапливать вторичные метаболиты. Клетки растений можно выращивать в искусственных условиях неопределенно долго (каллусы женьшеня растут в культуре in vitro уже более 50 лет), а путем различных манипуляций часто удается повысить содержание вторичных метаболитов. Кроме того, система растительной клетки in vitro – это удобная модель для изучения вторичного метаболизма, поскольку исследователь может управлять функционированием клетки через изменение условий культивирования или экспрессии генов.

В настоящее время растет спрос на лекарственные препараты природного происхождения. Экстракты лекарственных растений широко применяют в медицине, парфюмерии и пищевой промышленности (Ullah and Khan, 2008). Активно изучаются антиоксидантные и противовоспалительные свойства растительных полифенолов (Ivanauskas et al., 2008; Ueda et al., 2002). Известно, что эти вещества перспективны для профилактики и лечения заболеваний почек, связанных с нефритом. Так, при лечении диабетической нефропатии применяются метаболиты кофейной кислоты – розмариновая кислота (содержит два остатка кофейной кислоты) и литоспермовая кислота Б (содержит четыре остатка кофейной кислоты и является аналогом рабдозина) (Makino et al., 2002). Перечисленные вещества продуцируются клетками растений семейства бурачниковые (Boraginaceae).

На Дальнем Востоке произрастают несколько представителей этого семейства, в том числе редкий вид незабудочник шелковистый (Eritrichium sericeum Lehm. DC.). Это растение содержит наибольшее среди других представителей бурачниковых количество интересующих нас полифенолов, однако его промышленное использование невозможно без использования методов биотехнологии. Разработка новых лекарственных средств на основе клеточных культур E. sericeum является перспективной задачей для биотехнологии растений.

В настоящее время в биотехнологии широко используются методы генетической инженерии. Так, например, в последние годы выявлены гены, оказывающие существенное влияние на продукцию вторичных метаболитов в культурах клеток растений, в том числе гены rol Agrobacterium rhizogenes. В большинстве случаев эти гены активируют биосинтетическую способность культур (Bulgakov, 2008). К сожалению, информация о механизме действия продуктов этих генов на вторичный метаболизм очень ограничена. Влияние генов rol на биосинтез полифенолов, продуктов фенилпропаноидного биосинтетического пути, ранее не исследовалось. В настоящей работе приведена сравнительная характеристика продукции метаболитов кофейной кислоты в обычной и rolC-трансгенной культурах клеток E. sericeum.

Цели и задачи исследования

Целью работы являлось изучение биосинтеза метаболитов кофейной кислоты в культурах клеток незабудочника шелковистого и получение продуктивной клеточной линии. В рамках поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

  • получить контрольную и экспрессирующую ген rolC культуры клеток E. sericeum;
  • увеличить выход метаболитов кофейной кислоты в культуре клеток E. sericeum посредством селекции и воздействия элиситоров;
  • исследовать связь между экспрессией гена rolC и экспрессией некоторых ключевых генов биосинтеза метаболитов кофейной кислоты;
  • исследовать фармакологическое действие полифенолов из культуры клеток E. sericeum.

Научная новизна работы

Показано, что клеточные культуры незабудочника шелковистого синтезируют метаболиты кофейной кислоты в больших количествах, многократно превышающих содержание этих веществ в природных растениях. Установлена зависимость действия гена rolC на продукцию метаболитов кофейной кислоты от времени культивирования каллусов – с возрастанием числа пассажей ген проявляет активирующее влияние на вторичный метаболизм. В культурах клеток E. sericeum обнаружен ген CYP98A3, кодирующий специфическую форму цитохром Р450-зависимой монооксигеназы, вовлеченную в биосинтез розмариновой кислоты. Установлена взаимосвязь экспрессии CYP98A3 с экспреcсией гена rolC и повышением содержания метаболитов кофейной кислоты в rolС-трансгенной культуре клеток.

Практическое значение работы

Получена клеточная культура незабудочника шелковистого, которая является воспроизводимым источником метаболитов кофейной кислоты. Максимальное содержание рабдозина в ней составляет 4.11% от сухого веса ткани, что является самым высоким содержанием этого вещества в природных и биотехнологических источниках. Показано, что полифенолы из культуры клеток E. sericeum обладают выраженным антиоксидантным действием, снижают симптомы при остром воспалении, что делает их перспективными для углубленного фармакологического изучения с целью создания в дальнейшем медицинских препаратов.

Апробация работы и публикации

Результаты исследований были представлены на конференции молодых ученых Биолого-почвенного института ДВО РАН (2006), II Международном конгрессе по молекулярному размножению растений (2nd International Conference on Plant Molecular Breeding) (КНР, Санья, 2007), 21-м Тихоокеанском научном конгрессе (21st Pacific Science Congress) (Япония, Окинава, 2007), Международной конференции по биоинформатике (International Multi-conference of Engineers and Computer Scientists) (Гонконг, 2008), 13-м Международном симпозиуме по биотехнологии "13th International Biotechnology Symposium and Exhibition (IBS-2008)" (КНР, Далянь, 2008). По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 98 страницах, иллюстрирована 19 рисунками и содержит 12 таблиц. Список литературы содержит 90 наименований, из них 77 на английском языке.

Финансовая поддержка

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов ФЦНТП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники" "Научные школы" НШ-6923.2006.4., Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология" и РФФИ/ДВО 06-04-96008.

Благодарности

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю В.П. Булгакову за внимательное и конструктивное руководство, благодарность сотрудникам группы биоинженерии К.В. Киселеву за помощь в освоении методик молекулярной биологии и руководство при выполнении генетической части настоящей работы, Г.К. Чернодед за помощь в работе с культурами клеток, Ю.Н. Шкрыль за методическую помощь. Автор выражает благодарность сотрудникам ТИБОХ ДВО РАН С.А. Федорееву и М.В. Веселовой за сотрудничество и помощь в определении качественного и количественного состава полифенолов культур клеток и корней E. sericeum, а так же коллегам из Алтайского государственного медицинского университета под руководством проф. Зверева Я.Ф. за выполнение фармакологических исследований.

Материалы и методы ИССЛЕДОВАНИЯ

контрольные и rolC-трансгенные клеточные культуры незабудочника шелковистого были получены из стерильных проростков. При агробактериальной трансформации использовали Agrobacterium tumefaciens GV3101, несущую бинарную векторную систему, состоящую из двух плазмид. Первая, рМР90RK vir-хелперная плазмида, содержит vir-белки (a, b, g, c, d, e), осуществляющие перенос и интеграцию Т-ДНК в хромосому растительной клетки (рис 1б). Вторая составляющая бинарного вектора, PCV002-35S-rolC – плазмида, содержащая в составе Т-ДНК целевой ген rolC под контролем сильного вирусного промотора 35S и маркерный ген устойчивости к канамицину nptII, кодирующий неомицин-фосфотрансферазу (рис.1в). В качестве контроля использовали культуру, трансформированную "пустым" вектором pPCV002, не содержащим целевого гена (рис. 1а).

Рис. 1. Физическая карта бинарной векторной системы

а "Пустой" вектор, использовался для получения контрольной культуры; б vir-хелперная плазмида, осуществляющая перенос и интеграцию Т-ДНК в хромосому растительной клетки; в плазмида, несущая ген rolC

Первичные каллусы E. sericeum, трансформированные как "пустой" плазмидой pPCV002 (культура Es-vector), так и pPCV002-35S-rolC (культура Es-rolC) спонтанно формировали адвентивные корни, из которых были получены культуры корней. Высокопродуктивная клеточная линия Е-4, использовавшаяся в фармакологических исследованиях, была получена из первичного каллуса Es-vector.

Препараты ДНК из культур клеток E. sericeum выделяли методом 2-кратного СТАВ буфера (Дрейпер, 1991). Для выделения РНК использовали метод, разработанный для растений с высоким содержанием вторичных метаболитов (Bekesiova, 1999). Реакцию обратной транскрипции (ОТ) проводили при помощи набора для синтеза первой цепи кДНК (Силекс, Россия).

Праймеры к гену актина E. sericeum были разработаны на основе секвенированного участка, включающего интрон. Продукты амплификации с матриц ДНК и кДНК составляли 290 и 206 п.н., соответственно. Праймеры к гену rolC были подобраны на основе известной последовательности гена rolC и фланкировали фрагмент размером 394 п.н. Для оценки относительного уровня экспрессии генов CYP и PAL в контрольной и rolC-трансгенной культурах E. sericeum использовали метод полимеразой цепной реакции (ПЦР) с вырожденными праймерами, разработанными на основе известных аминокислотных последовательностей CYP и PAL разных видов растений. Эти праймеры фланкировали фрагменты 256 и 266 п.н. для CYP и PAL, соответственно.

Уровень экспрессии генов определяли при помощи биоанализатора Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, USA) и нормировали относительно экспрессии гена актина E. sericeum (используя те же препараты кДНК, что применялись для анализа CYP и PAL). Продукты ОТ-ПЦР генов CYP и PAL были клонированы в вектор pTZ57R/T (Fermentas, Литва). Клоны амплифицировали с праймерами M13 и секвенировали при помощи набора Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA) согласно протоколу фирмы-производителя. После осаждения этанолом первичная последовательность нуклеотидов была определена на секвенаторе ABI 310 Genetic Analyser (Applied Biosystems). На основе секвенированных участков генов были получены аминокислотные последовательности транскриптов при помощи программы Gene runner 3.05. Далее их сравнивали с известными аминокислотными последовательностями CYP и PAL других видов растений в программе NCBI BLAST. Филогенетическое дерево строили в программе ClustalX. Значения экспрессии генов, выраженные в относительных единицах, получали на основе данных по суммарной экспрессии генов CYP (полученных в результате ОТ-ПЦР с дегенеративными праймерами) и данных по количественному распределению секвенированных клонов. Эти данные подтвердили при помощи ПЦР в реальном времени, проведенной согласно методу Giulietti et al. (2001). Последовательности праймеров и TaqMan-зондов для генов CYP98A3 и rolC разрабатывали при помощи программы Primer Premier 5.0.

Качественный и количественный анализ полифенолов проводили совместно с лабораторией химии природных хиноидных соединений ТИБОХ ДВО РАН физико-химическими методами – 13C ЯМР, масс-спектрометрии (FAB-MS), ИК и УФ-спектроскопии, спектроскопии кругового дихроизма и ВЭЖХ согласно опубликованным методикам (Fedoreyev et al., 2005).

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»