WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |   ...   | 12 |

Фракция 1 (mGroP 1,3), стрептомицетыMB-2, MB-5, MB-6. Продукты кислотного гидролиза(табл. 1) свидетельствовали о том, чтофракция 1, вероятно, является1,5-поли(рибитфосфатом), несущим остаткипировиноградной кислоты. Предположениебыло подтверждено даннымиЯМР-спектроскопического анализа. Фракция 2,(mGroP 0,9-1,1), все 5стрептомицетов. Профили продуктовкислотного и щелочного гидролизов этойфракции указывали на поли(рибитфосфатную)природу ТК из нее. Образование при щелочномгидролизе фосфорного эфира,идентифицированного какглюкозилрибитфосфат, а при HF-гидролизегликозида, определенного какглюкозилрибит, свидетельствовало о том,что полимером фракции 2, вероятно, являлся1,5-поли(рибитфосфат), замещенный глюкозой,что было подтвержденоЯМР-спектроскопическими исследованиями.Фракция 3 (mGroP0,45-0,52), для 4-х стрептомицетов, кроме МБ-10.Кислотный гидролиз привел к образованиюгалактозамина, а такженеидентифицированного нингидринположительного соединения, и, кроме того,следовых количеств продуктов деградацииТК из фракции 2. Структура полимера этойфракции была установлена методамиЯМР-спектроскопии для каждого организма.Это была тейхуроновая кислота: 4)--D-ManpNAcA-(13)--D-GalpNAc-(1, найденная ранее(Шашков и др., 2001) у стрептомицетов. Фракция 4(mGroP 0,34), длявсех стрептомицетов, за исключением МВ-5.Окрашивалась реактивом Ишервуда в серыйцвет, в кислотных гидролизатах этойфракции найдена глюкоза инеидентифицированное соединение,окрашивающееся азотнокислым серебром.Структура полимера этой фракции быларасшифрована с помощьюЯМР-спектроскопических исследований. Имоказался полимер 3-дезокси-D-глицеро-D-галакто-нон-2-улопиранозоновой кислоты (Kdn),замещенный -глюкозой (Shashkov et al., 2000).

Итак, клеточные стенки5-ти стрептомицетов содержали по два-четыреанионных углеводсодержащих полимера.Среди них ТК: 1,5-поли(рибитфосфат), разнойстепени замещения -Glcp,встречающийся во всех изученныхорганизмах; а также 1,5-поли(рибитфосфат),несущий кетально связанную по гидроксилампри С2-С4 рибита пировиноградную кислоту,который был обнаружен в клеточных стенкахлишь трех (МБ-2, МБ-5, МБ-6) стрептомицетов. Для4-х изученных организмов характерноналичие в клеточных стенках тейхуроновойкислоты. Клеточные стенки почти всехизученных стрептомицетов (кроме МБ-5)содержат полимер Kdn, замещенный -Glcp (табл. 9, Тульская идр, 2003).

Streptomyces sp.ВКМ Ас-2534 (=Ив-219). Продукты кислотного гидролизаклеточной стенки и суммарного препаратаполимеров указывали на присутствие ТКполи(рибитфосфатной) природы (табл. 1),видимо, с глюкозой и глюкозамином вкачестве заместителей, а такженеидентифицированного нингидринположительного соединения. Электрофорезсуммарного препарата привел к разделениюна две фракции, которые были накопленыэлектофоретически, элюированы,лиофилизированы и исследованы отдельно.

Фракция 1 (mGroP1,10), минорная, содержала ТКрибитфосфатной природы, вероятно, несущейв качестве заместителей глюкозу иглюкозамин, о чем свидетельствовалипродукты кислотного гидролиза (табл. 1). Приаммонолизе фракции образовались лизин иамид лизина, последний, по-видимому, входилв структуру ТК. Изучение продуктовдефосфорилирования (HF-гидролиз) привело кобнаружению двух гликозидов,идентифицированных как: Г1 – глюкозилрибит; Г2–N-ацетилглюкозаминилрибит. Можно былопредположить, что полимер этой фракциипредставляет собой 1,5-поли(рибитфосфатную)ТК, отдельные рибитфосфатные остаткикоторой несут глюкозу, в то время какдругие –замещены N-ацетилглюкозамином. Фракция 2(mGroP 0,52), преобладающая, была проявленареактивом Ишервуда в виде белого пятна нафореграмме. Кислотные гидролизаты этойфракции содержали лишь следовыеколичества продуктов деградации фракции 1,а также неидентифицированное нингидринположительное соединение. Таким образом,ТК не являлась основным компонентом этойфракции.

Тип фосфодиэфирнойсвязи, положение гликозильныхзаместителей и их конфигурация в ТКфракции 1, а также структура полимера изфракции 2 были определены с помощьюЯМР-спектроскопии.

Таким образом, былодоказано, что клеточная стенка изучаемогофитопатогенного стрептомицета содержитдва анионных углеводсодержащих полимера.Минорный полимер – ТК, 1,5-поли(рибитфосфатные) цепикоторой несут по гидроксилам при С-2(4)рибита -глюкопиранозу, однако некоторыерибитфосфатные звенья полимера замещены-N-ацетилглюкозамином, нарушая темсамым его регулярность. Второй полимер,преобладающий, представлял собойтейхуроновую кислоту, повторяющейсяединицей которой является дисахарид:

4)--D-Manp2,3NAcyA-(13)--D-GalpNAc-(1, где Acy – ацетил или L-Glu

Полимер такой структурыобнаружен впервые у грамположительныхбактерий (табл. 9, Тульская и др., 2007б).

5.5. Тейхоевая кислота и полисахаридклеточной стенки Kineosporiaaurantiaca ВКМ Ас-702Т.

К началу нашихисследований имелись сведения (Евтушенко идр., 1984) о том, что клеточная стенка Kineosporia aurantiaca ВКМАс-702Т,представителя семейства Kineosporiaceae подпорядкаFrankineae,содержит ТК глицерофосфатной природы.Однако структурные исследованияпоследней, а также возможных другихгликополимеров, имеющихся в ней, ранее непроводили.

В кислотныхгидролизатах клеточной стенки исуммарного препарата из неё обнаруженыгалактоза и манноза, а также некотороеколичество глицерина, его моно- ибисфосфатов, неорганический фосфат иглюкозамин. Электрофорез суммарногопрепарата обнаружил наличие двух фракций,которые были накоплены методомпрепаративного электрофореза, элюированы,лиофилизированы и исследованы отдельно.

Фракция 1 (минорная,mGroP 0,93) прикислотном гидролизе дала продукты,позволяющие предположить наличиеглицеринтейхоевой кислоты,замещенной глюкозамином (табл. 1). Ценнаяинформация о структуре ТК была полученапри изучении фосфорных эфиров, полученныхпосле щелочного гидролиза фракции 1, атакже гликозидов, полученных после ееобработки 47%-ной HF. Полученные продуктыгидролизов, изученные по схеме,приведенной для S.сastelarensis, оказалисьидентичными таковым для названногострептомицета. Таким образом, следовалодумать, что полимер из фракции 1 является1,3-поли(глицерофосфатом) частичнозамещенным -глюкозаминильными остатками,только часть которых N-ацетилирована. Этопредположение было подтвержденоЯМР-спектроскопическими исследованиями.Фракция 2 (основная) была электронейтральнаи проявлена на фореграмме AgNO3 в нейтральнойобласти. При кислотном гидролизе найденыгалактоза и манноза в соотношении ~ 1 : 2.Абсолютная конфигурация галактозы иманнозы определена методом ГЖХ после ихпревращения в ацетилированные (S)-октан-2-ил гликозидысравнением с октан-2-ил D-гликопиранозами(Gerwig et al., 1979). Эти результаты показали, чтоданная фракция вероятнее всего содержитнейтральный полисахарид. Структурапоследнего была полностью расшифрована спомощью ЯМР-спектроскопии.

Моносахариднаяпоследовательность в повторяющейсяединице полисахарида установлена наосновании анализа 1H, 1H ROESY и1H, 13C HMBC спектров:

3)--d-Galp-(16)--d-Manp-(14)--d-Manp-(13)--d-Galp-(14)--d-Manp-(14)--d-Manp-(1.

ОдинаковаяD-конфигурация каждого из моносахаридныхостатков подтверждена при определениигликозилирующих эффектов в 13C ЯМР спектрахполисахарида (Lipkind et al., 1988; Shashkov et al., 1988).Структура данного нейтральногополисахарида описана впервые(Tul’skaya et al., 2005).

Анализ собственныхрезультатов и литературных данныхуказывает на широкое распространениетейхоевых кислот в клеточных стенкахпредставителей порядка Actinomycetales: более 80% всехизученных нами к настоящему времеништаммов актиномицетов содержат этиполимеры, причем до 70% всех обнаруженныхтейхоевых кислот составляютглицеринтейхоевые кислоты. Рибиттейхоевыекислоты менее распространены в клеточныхстенках бактерий. И, наконец, тейхоевыекислоты, содержащие другие полиолы(эритрит, арабит, маннит, 6-О-метил-галактит)в коре полимера, выявлены у актиномицетов вредких случаях, рис. 4.

Рис. 4. Известные внастоящее время полиолы, входящие в составтейхоевых кислот.

Заметим, что именно дляглицеринтейхоевых кислот обнаруженонаибольшее разнообразие (рис. 4.) влокализации фосфодиэфирных связей: 1,3- и2,3-поли(глицеринфосфаты),поли(гликозилглицеринфосфаты),поли(глицеринфосфат-гликозилглицеринфосфаты).Недавно найден новый тип тейхоевых кислот:поли(ацилгликозилглицерофосфат),фосфодиэфирная связь в которомосуществляется по гидроксилу при С2глицериновой кислоты, ацилирующейхиновозамин в коре полимера, и гидроксилупри С3 остатка глицерина (Козлова и др.,неопубликованные данные).

Итак, глицеринтейхоевыекислоты наиболее широко распространены вприроде, и среди них выявлено наибольшееразнообразие структур.

Интересные данные былиполучены в наших совместных работах ссотрудниками группы чл.-корр. РАНИ.С.Кулаева (Кулаев и др., 1996; Степная и др.,1997, 2004). Бактерии с глицеринтейхоевойкислотой были практически не подверженыдействию комплекса литических ферментов,тогда как наличие рибиттейхоевой и/илитейхуроновой кислот приводило кусиленному лизису микроорганизмов.Возможно, глицеринтейхоевые кислотызащищают микробную клетку от лизиса.

Являются лиглицеринтейхоевые кислоты наиболеезначимыми для выживания микроорганизмов вих экологической нише по сравнению сдругими тейхоевыми кислотами, в корекоторых имеются другие полиолы, предмет дальнейшихисследований.

Глава VI. Тейхоевыекислоты клеточных стенок каквидоспецифический маркер актиномицетов.

Ранее было показаноуспешное применение признака “наличиетейхоевых кислот” для разделениястафилококков и микрококков (Schleifer andStackebrandt, 1983):первые содержат ТК, вторые – нет. Идея овозможности использования ТК всистематике актиномицетов была выдвинутавпервые немецкими исследователями длярода Brevibacterium(Fiedler et al., 1981) и развита в работе И.Б.Наумовой(Naumova, 1988).

Участие ТК клеточныхстенок в жизненно важных процессах,происходящих в живой бактериальной клетке(Neuhaus and Baddiley, 2003; Weidenmaier and Peschel, 2008), ихколоссальное структурное разнообразие (см.Главу V, обзоры: Наумова и Шашков, 1997;Потехина, 2006; Naumova et al., 2001),детерминированное информацией,содержащейся в кодирующих их генах (Lazarevic etal., 2002), а также их широкое распространение вграмположительных бактериях (наши данные;Weidenmaier and Peschel, 2008), с очевидной вероятностьюдемонстрируют возможность их применения всистематике бактерий.

С начала 70-х годов втаксономической практике успешноиспользуется строение пептидогликана(Schleifer and Kandler, 1972) – основного гликополимера клеточнойстенки прокариот. Тогда кактаксономическая значимость структур ТК идругих гликополимеров клеточной стенки стаксономической точки зрения не оценена вполной мере, поскольку до сих пор непроводилось направленного анализа с цельюобнаружения коррелятивных связей междуналичием и структурой ТК и гликополимеровклеточных стенок актиномицетов итаксономическим статусом последних. Кнастоящему времени показана возможностьиспользования тейхоевых кислот в качествевидоспецифического маркера дляпредставителей родов Agromyces (Гнилозуб, 1994),Actinomadura, Nonomureaи Brevibacterium(Потехина, 2005).

В настоящей главеанализируются полученные автором илитературные данные о структурных типах иподтипах ТК, обнаруженных в клеточныхстенках представителей нескольких родовактиномицетов (Nocardiopsis, Glycomyces,Nocardioides, Streptomyces),принадлежащих 4-м различным семействамчетырех подпорядков порядка Actinomycetales.

6.1. Структуры и набортейхоевых кислот клеточных стенок каквидоспецифические маркеры видов иподвидов рода Nocardiopsis.

В данном разделепроанализированы собственные результаты(29 штаммов) и литературные данные (5 штаммов)исследования клеточных стенок 34 штаммов,принадлежащих к 13 видам и подвидам родаNocardiopsis(семейство Nocardiopsaceae, подпорядок Streptosporangineae, Fisher et al.,1983; Yassin et al., 1993; 1997; Evtushenko et al.,

Таблица 2.Тейхоевые кислоты клеточныхстенок видов и подвидов рода Nocardiopsis.

Тейхоевая кислота

N.dassonvillei ssp.dassonvillei

N.synnematofor-mans

N.halotolerans

N.dassonvillei ssp. albirubida1

N. alba(3 strains)

N. listeri2

N.metallicа

N. prasina

N.lucentensis 2

N.compostа

N. trehalosi

N.tropica3


ГруппаN. dassonvillei

Группа N. alba



Поли(глицерофосфат--N-ацетилгалактозаминилглицерофосфат)/связь –3-P-3 –











Поли(глицерофосфат--N-ацетилгалактозаминилглицерофосфат)/связь –3-P-4 –











Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |   ...   | 12 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»